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研究目的:Sohlh1（Spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix 1）基因的蛋白含有螺旋环螺旋结构域,属b HLH家族,是生殖细胞特异性表达的转录因子。Sohlh1主要表达于精原细胞中的A1A4期（此间精原细胞经历细胞增殖和细胞分化）,从B型精原细胞阶段开始表达逐渐减少。在Sohlh1基因敲除小鼠睾丸中,出生后14.5天精原细胞大量凋亡,成年睾丸萎缩,不能生育。本研究团队前期研究发现,Sohlh1基因敲除小鼠表现为精原细胞向精母细胞分化受阻,精原细胞无法进入减数分裂期形成精母细胞而导致雄性不育。研究报道,SOHLH1蛋白直接正调控促精原细胞分化的转录因子Neurogenin 3（Ngn3）、SRY-box transcription factor 3（Sox3）和分化型精原细胞标志基因c-Kit转录,进而发挥促进精原细胞分化的作用。然而,Sohlh1是否调控精原细胞增殖尚不清楚。本研究前期通过基因芯片发现,在出生后（postnatal,PD）7.5天的Sohlh1基因敲除小鼠睾丸中Bmp7表达显著下调,且发现小鼠Bmp7启动子-2000+100bp范围内存在2个SOHLH1的结合位点E-box。在GEO数据库中检索Sohlh1基因敲除雄鼠睾丸中差异表达基因,发现Bmp7也表达显著下调,与我们的基因芯片结果一致。然而,SOHLH1蛋白是否直接转录调控Bmp7基因尚不清楚。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）通过Smad、PI3K/AKT等信号通路发挥生物学效应。Bmp7在交配后11.5天（days post coitum,dpc）之前在雌雄胚胎性腺中均有表达,但在12.5 dpc之后表达仅限于XY性腺。Bmp7对PI3K/AKT信号通路的激活作用在不同物种、不同组织、不同细胞中被广泛证实。在小鼠精原细胞中,激活PI3K/AKT信号通路能上调cyclin D3的表达,促进细胞周期从G1期到S期,进而发挥促进精原细胞增殖的作用。然而,Bmp7在精原细胞中是否激活PI3K/AKT信号通路;Sohlh1是否通过Bmp7激活PI3K/AKT信号通路,进而发挥促进精原细胞增殖的作用,以上问题尚不清楚。基于以上,本课题拟利用Sohlh1基因敲除小鼠和GC-1 spg精原细胞系,在动物和细胞实验中探讨SOHLH1蛋白对Bmp7的转录调控作用,及对PI3K/AKT信号通路的影响,阐明Sohlh1影响精原细胞增殖的分子机制。研究方法:一、个体水平本研究选取Sohlh1基因敲除雄鼠与C57BL/6J雄鼠为研究对象,利用免疫组化、Real-time PCR、Western blot方法对比分析PD 7.5天、8周睾丸中BMP7及PI3K/AKT通路蛋白的相对定位和定量。二、细胞水平利用GC1-spg小鼠精原细胞并通过上调或下调Sohlh1和Bmp7的表达水平,利用流式细胞术检测小鼠精原细胞凋亡;用CCK8及Ed U法检测细胞增殖率,探讨Sohlh1和Bmp7对PI3K/AKT通路的激活作用。三、分子水平在Bmp7启动子-2000+100 bp范围内,搜索获得2个转录因子SOHLH1的结合位点E-box基序,利用染色质免疫沉淀（Ch IP）实验验证SOHLH1是否直接结合于Bmp7启动子;构建野生型（wild type,WT）Bmp7启动子和含有突变E-box位点Bmp7启动子的荧光素酶表达载体,利用双荧光素酶报告基因研究转录因子SOHLH1对Bmp7启动子序列的转录调控作用。研究结果:一、成年Sohlh1基因敲除小鼠睾丸发育迟缓PD 7.5 d Sohlh1敲除（knock out,KO）雄鼠与WT C57BL/6J雄鼠相比,小鼠睾丸外观并无明显差异;但PD 8 W时,Sohlh1 KO雄鼠睾丸明显小于WT C57BL/6J雄鼠睾丸。二、Sohlh1基因敲除小鼠睾丸Bmp7及PI3K/AKT信号通路基因及蛋白表达下调小鼠睾丸免疫组化结果显示,PD 7.5 d时,与WT型睾丸相比,在KO型睾丸中,SOHLH1在精原细胞中无表达,间质细胞中亦无表达;BMP7蛋白在精原细胞中表达减少,间质细胞中表达无差异;PI3K蛋白在精原细胞中表达减少,间质细胞中表达无差异;AKT蛋白在精原细胞中表达减少,间质细胞中表达无差异;pho-PI3K蛋白在精原细胞中表达减少,间质细胞中表达无差异;pho-AKT蛋白在精原细胞中表达减少,间质细胞中表达无差异。小鼠睾丸免疫组化结果显示,PD 8 w时,与WT型雄鼠睾丸相比,在KO型睾丸中,SOHLH1在精原细胞中无表达,间质细胞中亦无表达;BMP7蛋白在精原细胞中表达明显减少,间质细胞中表达无差异;PI3K蛋白在精原细胞中表达明显减少,间质细胞中表达无差异;AKT蛋白在精原细胞中表达明显减少,间质细胞中表达无差异;pho-PI3K蛋白在精原细胞中表达明显减少,间质细胞中表达无差异;pho-AKT蛋白在精原细胞中表达明显减少,间质细胞中表达无差异。小鼠睾丸Real-time PCR结果显示,与WT型睾丸相比,7.5 d时KO睾丸中Sohlh1及Akt基因表达水平下调,且差异极显著（P＜0.01）;Bmp7及PI3K表达下调,差异显著（P＜0.05）。与WT型睾丸相比,8 w KO小鼠睾丸中Bmp7、Sohlh1、PI3K及Akt表达下调,且差异极显著（P＜0.01）。小鼠睾丸Western blot结果显示,与WT型睾丸相比,7.5 d KO小鼠睾丸中SOHLH1、AKT及pho-AKT蛋白表达下调,且差异极显著（P＜0.01）;BMP7、PI3K及pho-PI3K蛋白表达下调,差异显著（P＜0.05）。与WT型睾丸相比,8 w KO小鼠睾丸中BMP7、SOHLH1、pho-PI3K、AKT及pho-AKT蛋白表达下调,且差异极显著（P＜0.01）;PI3K蛋白表达下调,差异显著（P＜0.05）。三、Sohlh1 si RNA敲减后诱导小鼠GC1-spg细胞增殖率下降、细胞凋亡率升高Sohlh1干扰组于细胞转染处理后24、48、72小时与对照组相比,增殖率显著下降（P＜0.05）。Ed U染色结果显示,细胞转染后48小时,Sohlh1干扰组细胞增殖率显著低于Sohlh1过表达组和对照组（P＜0.05）。Sohlh1干扰后48小时,细胞凋亡率高于空白对照组,差异极显著（P＜0.01）。四、Sohlh1 si RNA敲减后BMP7及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达下调GC1-spg细胞Sohlh1 si RNA敲减后,Western blot结果显示,BMP7、PI3K、AKT、pho-PI3K及pho-AKT蛋白表达显著下调,与睾丸Western blot结果一致。但Sohlh1敲减下调PI3K/AKT信号通路蛋白可被Bmp7过表达部分回复。五、转录因子SOHLH1结合于Bmp7启动子且对Bmp7具有正调控作用Ch IP结果证实SOHLH1结合于Bmp7启动子-97 bp-92 bp位点的E-box;双荧光素酶报告基因证实SOHLH1蛋白对Bmp7启动子具有转录促进作用。研究结论:1、在小鼠睾丸中,Sohlh1基因敲除小鼠精原细胞中BMP7表达下调、PI3K/AKT信号通路被抑制。2、在小鼠GC1-spg精原细胞中,Sohlh1敲减抑制精原细胞增殖和促进凋亡,抑制BMP7蛋白表达和PI3K-AKT信号通路。3、SOHLH1蛋白直接结合Bmp7启动子,对Bmp7基因有正调控作用。