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5’-脱氧核苷酸(dTMP、dCMP、dGMP、dAMP)具有多种重要的生理功能,其临床上主要用于大面积创伤修复、心血管疾病、血液疾病、抗癌抗病毒等的辅助治疗,同时5’-脱氧核苷酸也是一种极具开发潜能的原料药,以其作为原料可以合成寡聚脱氧核苷酸以及齐多夫定、阿巴卡韦等等在临床上被大量使用的药物。同时,脱氧核苷酸还有很好的抗衰老、保健作用,市场前景广阔。
虽然目前国内有混合脱氧核苷酸药物的生产,但是很少有公司能生产单脱氧核苷酸,偶尔有所报道也存在产品质量不高,产量低和成本高等问题。为改变国内单脱氧核苷酸的生产现状,在本实验室成熟的DNA酶解工艺基础上,本文从大规模工业化生产脱氧核苷酸角度出发,利用成本低廉的酶解-离子交换分离的方法生产脱氧核苷酸。
由于稳定性研究对于后期动态树脂分离时间的控制以及各种工艺条件的考察可以提供理论指导,本文研究了脱氧核苷酸的稳定性问题,考察了脱氧核苷酸在不同温度和pH值条件下的降解情况,为防止脱氧核苷酸在分离纯化过程中的降解损失做了前期准备。
由于四种脱氧核苷酸的理化性质很相近,而且DNA酶解液中各种杂质含量较多,导致下游分离纯化很困难。目前国内在分离方面存在的缺点是:所用树脂的分离度低;树脂利用率低;产品的收率较低等。
针对以上问题,本文提出了如下的分离策略:首先,由于DNA酶解液中蛋白含量高,杂质种类多的特点,提出了用盐酸沉淀蛋白,离心,超滤等方法对DNA酶解液进行预处理,得澄清液,达到了上柱要求。
其次,虽然DNA酶解液中杂质含量很高、种类多,但是为简化工艺,缩短生产周期,本文尝试只通过一种阳离子交换树脂对脱氧核苷酸进行分离。自行合成了数种阳离子交换树脂,进行静态筛选得到NH-1树脂。该树脂对四种脱氧核苷酸均有较高的吸附容量,而且吸附选择性良好。同时,通过对NH-1树脂吸附过程中动态吸附、洗脱条件的研究,得到了适合从DNA酶解液中分离四种脱氧核苷酸的各种工艺条件,只通过NH-1树脂洗脱四种脱氧核苷酸(dTMP、dCMP、dGMP、dAMP)的收率分别达到74.3%、85.4%、68.5%、77.6%,纯度分别达到89%、93%、82%和88%,均超过了国内外文献报道的水平。
用上述方法分离脱氧核苷酸过程简单,对设备要求不高,生产成本低,适合于大规模工业化生产的要求。