目的:采用新型 CRISPR-PITCH（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Precise Integration into target chromosome）系统构建稳定表达内源性CSDE1-EGFP的B16黑色素瘤细胞系。流式细胞分选仪根据EGFP的荧光强度分选出低表达含E1的冷休克域（Cold shock domain with E1,CSDE1）与高表达含E1的冷休克域的B16细胞株,并对这两种细胞株进行功能方面的探讨。同时通过建立这个新型CRISPR-PITCH双系统敲入技术为后来的开发新的药物靶点提供技术支持。方法:利用CRISPR-PITCH系统将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）编码序列插入到CSDE1基因组最后一个外显子上;采用流式细胞分选仪分选、提取细胞基因组DNA进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）基因分型分析来检测CSDE1-EGFP融合蛋白是否成功插入;采用蛋白质印迹技术（Western blotting,WB）,实时荧光定量PCR（Real-Time PCR,qPCR）方法来观察两种细胞株CSDE1表达量是否有差异;采用活细胞成像（Live cell imaging）及免疫荧光染色（Immunofluorescent staining,IF）实验检验EGFP的荧光强弱与CSDE1的表达高低是否一致;采用Transwell实验、小鼠荷瘤实验、肺转移实验观察低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株之间的功能差异。结果:通过微同源介导的末端连接辅助方法（Microhomology-mediated end-joining,MMEJ）,将EGFP编码序列成功插入CSDE1基因中,流式细胞分选仪分选出低表达CSDE1与高表达CSDE1的B16细胞株,EGFP表达强弱与CSDE1表达高低一致。WB,qPCR的实验结果验证了高低表达不同CSDE1之间确实存在差异;同时观察发现CSDE1蛋白表达量不同的黑色素瘤细胞在功能上也有所差异,与低表达CSDE1的B16细胞相比,高表达CSDE1的B16细胞在转移能力、侵袭能力和成瘤能力明显更强。结论:以新型CRISPR-PITCH系统基因敲入技术为研究CSDE1在其他肿瘤细胞内的动态定位,以及因表达量不同而产生的功能差异提供快速有效的直观方法,更是为未来能够研究各种靶基因在不同细胞上提供了技术经验。