目的:生活水平提高、久坐不动的生活模式及社会老龄化等多种因素,导致糖尿病发病率的迅猛增加。2型糖尿病是多种因素共同作用的结果,其中胰岛素抵抗是2型糖尿病的病理基础之一。胰岛素抵抗是指正常剂量的胰岛素生物学效应低于正常的一种状态,发生在肝细胞、肌细胞、脂肪细胞等组织细胞中。以下三种情况均可引起胰岛素抵抗,分别是胰岛素受体前缺陷、胰岛素受体缺陷和胰岛素受体后缺陷,其中受体后缺陷与胰岛素信号通路在细胞内传递异常有关,包括IRS家族异常、PI3-激酶(PI3K)信号通路异常、葡萄糖载体蛋白(Glut)异常、细胞内葡萄糖磷酸化障碍等。正常情况下,胰岛素与靶细胞膜特异受体相结合,通过激活细胞内一系列信号级联反应通路,胰岛素信号被转导入细胞内部。但当胰岛素信号传导通路异常出现胰岛素抵抗时,胰岛素对细胞的生物效应下降,葡萄糖分解利用率降低机体糖平衡紊乱。因此进一步深入探究靶细胞胰岛素抵抗的具体分子机制,对于明确糖尿病的发病原因和治疗方法有重要意义。蛋白激酶Cζ(PKCζ)属于非典型PKC家族成员,位于PI3K信号通路下游,在多种细胞外刺激因素作用下参与细胞内信号转导通路调控多种细胞生理功能。在胰岛素刺激下PKCζ通过调控AMPK等因子影响下游通路蛋白,是调控细胞糖摄取,影响细胞糖平衡的重要因子之一,但是目前对PKCζ激活的具体分子机制善不清楚。因此,了解PKCζ在胰岛信号通路中的激活机制及其影响因素对更好的阐述PKCζ的功能有重要意义。方法:1、siRNA转染后选取一个成功降表达序列,构建SIN1降表达Hep G2细胞株,葡萄糖氧化酶法检测SIN1下调后对细胞葡萄糖摄取率的影响;2、免疫共沉淀和免疫荧光共聚焦技术探究胰岛素刺激下Hep G2细胞SIN1与PKCζ是否存在结合关系,质粒转染删除SIN1的Pleckstrin Homology domain(PH结构域),免疫共沉淀检测结合关系是否依然存在;3、Western blotting方法检测SIN1缺乏对PKCζ磷酸化及PKCζ转位的影响,以明确SIN1与PKCζ的活化是否有关,进而影响细胞糖摄取;4、质粒转染过表达SIN1,观察SIN1上调对PKCζ磷酸化及转位的影响;5、免疫共沉淀和免疫荧光共聚焦技术探究胰岛素刺激下Hep G2细胞β-Tubulin与PKCζ是否存在结合关系;100 nmol/L胰岛素分别干预0 min、1 min、5 min、10 min、20 min、30 min,利用免疫共沉淀方法分别探讨SIN1、β-Tubulin与PKCζ结合关系随着刺激时间延长而变化的关系;6、紫杉醇(PTX)或诺考达唑(NDZ)分别处理4 h破坏细胞微管的解聚或聚合,100 nmol/L胰岛素刺激10 min,胞质胞膜分离,研究细胞微管破坏对PKCζ转位的影响,Western blotting检测微管破坏对PKCζ以及PKCζ下游信号分子丝切蛋白Cofilin磷酸化影响。结果:SIN1降表达后,HepG2细胞24 h摄糖量在无胰岛素刺激和胰岛素刺激下均下降,无胰岛刺激素时,细胞摄糖率由35.27%±2.77%下降至30.83%±2.34%(p<0.05),胰岛素刺激时,由39.95%±3.20%降至32.26%±3.61%(p<0.05),数据进一步分析显示,SIN1降表达细胞株对胰岛素刺激敏感度下降;免疫共沉淀和共聚焦结果均提示,SIN1与PKCζ存在结合关系,胰岛素刺激后结合依然存在并保持不变,SIN1 PH结构域删除后,结合减弱;胰岛素刺激下SIN1降表达细胞PKCζ磷酸化减弱,PKCζ转位受到抑制,与之相反,SIN1过表达增强PKCζ的磷酸化和转位。免疫共沉淀和共聚焦结果同时提示,β-Tubulin与PKCζ存在结合关系,胰岛素刺激后结合先减弱后增强,PTX与NDZ处理后,PKCζ转位受到抑制,PKCζ下游的Coffin磷酸化减弱。结论:本研究结果显示,静息状态,SIN1通过PH功能域与PKCζ形成稳定的结合关系,且胰岛素刺激下,这种结合仍然存在,并共同定位于细胞膜边缘。SIN1降表达后Hep G2细胞摄糖率减少,PKCζ磷酸化及转位也受到抑制,表明SIN1可能通过与细胞中PKCζ结合调控PKCζ的磷酸化及转位进而影响细胞糖平衡,同时β-Tubulin也参与PKCζ转位的调控,微管的聚散影响PKCζ活性及下游分子活性。在胰岛素刺激下,PKCζ借助微管平台被PI3K激活影响细胞糖代谢。