论文部分内容阅读
目的:探讨小白菊内酯(Parthnolide,PTL)对Kaposi肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s Sarcoma associated Herpesvirus,KSHV)感染细胞增殖和凋亡的影响。方法:(1)采用CCK-8测定不同浓度的小白菊内酯处理KSHV感染细胞24h后的半数抑制浓度(IC50)。(2)显微镜下观察不同浓度的小白菊内酯处理KSHV感染细胞24h和48h后细胞的形态变化。(3)采用CCK-8、集落形成实验检测不同浓度的小白菊内酯处理KSHV感染细胞后的增殖能力。(4)采用碘化丙锭PI染色法,流式细胞技术检测小白菊内酯处理KSHV感染细胞24h后细胞周期的变化,并用Western Blot检测不同浓度的小白菊内酯处理KSHV感染细胞后,细胞周期蛋白CDK4、CDK6和CyclinD1的表达。(5)采用Western Blot检测凋亡蛋白Bax和Bcl-2的表达。(6)采用Western Blot检测NF-κB蛋白IKKβ、P-p65和P-IKB-α的表达水平。(7)采用裸鼠成瘤实验检测小白菊内酯对体内肿瘤生长的影响。(8)采用免疫组织化学检测小白菊内酯对CDK6、CyclinD1、Bax、IKKβ、P-p65和P-IKB-α表达的影响。(9)采用实时荧光定量PCR检测小白菊内酯处理KSHV感染细胞24h后潜伏态基因LANA、V-FLIP、V-Cyclin和裂解态基因RTA、K8.1、V-GPCR的mRNA表达。(10)采用细胞免疫组织化学(Immunocytochemistry,ICC)检测小白菊内酯处理KSHV感染细胞24h后LANA、K8.1A和RTA的表达水平。结果:(1)小白菊内酯处理KSHV潜伏感染细胞iSLK.219、SK-RG细胞的IC50分别为21.08μmol/L、10.75μmol/L。(2)小白菊内酯改变了KSHV感染细胞的形态,使iSLK.219细胞变得细胞膨大、肿胀、变圆、脱落,而SK-RG细胞变圆,细胞质突起减少甚至消失,并且明显可以看见脱落的细胞。(3)小白菊内酯使KSHV潜伏感染细胞的增殖能力显著降低(P<0.01),并有明显的G1细胞周期阻滞作用(P<0.01)。同时,小白菊内酯使KSHV潜伏感染细胞周期蛋白Cyclin D1,CDK6,CDK4表达呈浓度依赖性降低。(4)小白菊内酯促进KSHV潜伏感染细胞的凋亡,使存活基因Bcl-2表达降低,促凋亡基因Bax表达升高,且呈浓度依赖性。(5)小白菊内酯使KSHV潜伏感染细胞NF-κB相关蛋白IKKβ、P-p65、P-IKB-α的表达呈浓度依赖性降低。(6)腹腔注射5mg/kg的小白菊内酯有减少裸鼠体内肿瘤体积的趋势,小白菊内酯处理组瘤体中凋亡相关因子Bax表达增加,周期因子Cyclin D1,CDK6和NF-κB相关因子IKKβ、P-p65、P-IKB-α的表达降低。(7)佛波酯诱导48h可使SK-RG细胞进入裂解态。(8)小白菊内酯处理KSHV裂解态细胞Lytic iSLK.219和Lytic SK-RG细胞的IC50分别为33.51μmol/L和28.53μmol/L。(9)小白菊内酯使KSHV裂解态细胞的增殖能力降低,并促进细胞凋亡,使存活基因Bcl-2表达降低,促凋亡基因Bax表达升高,且呈浓度依赖性。(10)小白菊内酯使KSHV病毒基因LANA、RTA、K8.1和V-GPCR表达降低。结论:(1)小白菊内酯对KSHV潜伏态和裂解态细胞均有抑制增殖和促进凋亡的作用。(2)小白菊内酯通过抑制cyclinD1和CDK4/6激酶复合物的活性,对KSHV潜伏感染的细胞有G1期阻滞作用。(3)小白菊内酯下调了KSHV潜伏感染细胞的NF-κB信号通路相关蛋白的表达,这可能与抑制细胞增殖并促进凋亡有关。(4)小白菊内酯抑制KSHV自身病毒基因的表达,可能作为抗KSHV感染及相关疾病的候选药物。