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目的:骨肉瘤是青少年常见的骨恶性肿瘤,在过去的很长一段时间里其治疗效果并未得到改善,部分病人会伴有肿瘤的转移,将会影响肿瘤患者的治疗,因此对于骨肉瘤转移相关蛋白的机制研究,有望为治疗骨肉瘤提供新方向以及新的治疗靶点。通过前期文献查阅发现,miR-506与多种癌症上皮间质转化密切相关,同时参与调控骨肉瘤细胞增殖、侵袭及凋亡等生命过程。同时有研究表明SPHK1参与调控肝癌细胞自噬及影响细胞上皮间质转化,并在多种肿瘤中存在高表达,与肿瘤恶性程度密切相关。虽有多篇文献报道了miR-506及SPHK1积极参与癌症的发生发展过程,但miR-506、SPHK1在骨肉瘤自噬及上皮间质转化上的机制研究尚未见报道。本课题通过对miR-506、SPHK1在骨肉瘤自噬及上皮间质转化上的研究进一步说明骨肉瘤的转移机制,为治疗骨肉瘤提供新的靶点和理论基础。研究方法:1.人骨肉瘤细胞hsa-miR-506-3p表达效率检测(1)将以下人成骨肉瘤细胞:MG63、143B、MNNG/HOS、SaOS-2、U-2OS细胞进行体外培养,采用Real-time PCR方法对上述细胞hsa-miR-506-3p和SPHK1的表达水平进行检测,采用Western blot方法对上述细胞SPHK1的表达水平进行检测;(2)合成hsa-miR-506-3p mimics及其NC对照(3)根据检测结果,从上述细胞系中选择hsa-miR-506-3p低表达、SPHK1高表达的2株细胞转染hsa-miR-506-3p mimics及其NC对照;(4)转染24h后,Real-time PCR方法检测hsa-miR-506-3p和SPHK1的表达水平;(5)转染48h后,Western blot方法检测SPHK1的表达水平。2.hsa-miR-506-3p对SPHK1的靶向检测采用双荧光素酶法检测工具细胞中has-miR-506-3p与SPHK1的靶向情况。3.hsa-miR-506-3p/SPHK1对人骨肉瘤细胞上皮间质转化和自噬的影响(1)构建SPHK1过表达质粒;(2)将SPHK1过表达质粒及空载体分别与hsa-miR-506-3p mimics或NC mimics共转染至人骨肉瘤细胞;(3)转染48 h后,相差显微镜拍照观测各组细胞形态改变;(4)转染24 h后,选用Transwell实验方法对各个组细胞24h侵袭能力进行检测;(5)转染48 h后,选用免疫荧光方法观测各组细胞E-cadherin的表达情况;(6)转染48 h后,选用Western blot方法检测各组细胞E-cadherin、Vimentind及Fibronectin表达程度。(7)转染48 h后,选用Western blot检测LC3II/I表达程度;4.验证hsa-miR-506-3p/SPHK1通过自噬影响人骨肉瘤细胞上皮间质转化(1)将hsa-miR-506-3p mimics及NC对照转染SaOS-2细胞,转染后24 h用自噬促进剂0.5μM Rapamycin处理24 h。选用Transwell实验方法检测各组细胞24 h侵袭能力。选用Western blot方法检测各组细胞E-cadherin、Vimentind,Fibronectin的表达情况。Western blot检测各组细胞LC3II/I 表达水平。(2)将SPHK1 mimics及NC对照转染至人骨肉瘤细胞143B和SaOS-2,转染后48 h用自噬抑制剂10mM 3-methyladenine处理6 h.Western blot检测各组细胞E-cadherin、Vimentind,Fibronectin的表达程度。结果:hsa-miR-506-3p在143B和SaOS-2细胞系中低表达,同时,SPHK1在143B和SaOS-2细胞系中高表达。将hsa-miR-506-3p mimics/NC对照转染到143B和SaOS-2中,检测在hsa-miR-506-3p mimics组中的hsa-miR-506-3p mRNA表达明显增高,hsa-miR-506-3p mimics组SPHK1的mRNA和蛋白水平明显下降。采用双荧光素酶法检测确定SPHK1是hsa-miR-506-3p的直接靶点。进行transwell侵袭实验显示,hsa-miR-506-3p过表达抑制细胞侵袭能力,而SPHK1过表达促进细胞侵袭能力,hsa-miR-506-3p过表达可部分减弱SPHK1对骨肉瘤细胞侵袭的促进作用。通过免疫荧光染色检测E-cadherin的表达水平和位置发现:hsa-miR-506-3p过表达可以靶向抑制143B和SaOS-2细胞中的SPHK1,使E-cadherin的表达增强;E-cadherin主要在骨肉瘤细胞的细胞质中表达。Western blotting在蛋白水平上证实了这一结果。当hsa-miR-506-3p mimics转染143B和SaOS-2细胞后,E-cadherin水平上调,Vimentind、Fibronectin、LC3II/I比值下调。SPHK1过表达质粒转染143B和SaOS-2细胞后,E-cadherin水平下调,Vimentind、Fibronectin、LC3II/I比值上调。从上述结果可知:hsa-miR-506-3p抑制143B和SaOS-2细胞上皮间质转化作用,SPHK1可促进143B和SaOS-2细胞上皮间质转化作用。hsa-miR-506-3p抑制143B和SaOS-2细胞自噬作用,SPHK1促进143B和SaOS-2细胞自噬作用。将miR-506-3p mimics和NC mimics转染SaOS-2细胞,miR-506-3p mimics组自噬促进剂0.5μM Rapamycin处理24 h。通过transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力,通过Western blotting检测EMT标记物(E-cadherin、Vimentind、Fibronectin)和自噬相关基因LC3II/I的表达水平。与miR-506-3p mimics组相比,Rapamycin+miR-506-3p mimics组的侵袭能力增强,上皮标记物(E-cadherin)蛋白表达下调,间充质标记物(Vimentind和Fibronectin)蛋白表达上调,自噬相关基因LC3II/I的表达水平升高。将SPHK1 mimics和NC mimics转染143B和SaOS-2细胞,自噬抑制剂10 mM 3-methyladenine处理6 h。随后,通过western blotting检测EMT标记物(E-cadherin、Vimentind、Fibronectin)表达水平。与SPHK1 mimics组相比,3-methyladenine+SPHK1 mimics组上皮标记物(E-cadherin)蛋白表达上调,间充质标记物(Vimentind和Fibronectin)蛋白表达下调。结论:hsa-miR-506-3p靶向作用SPHK1,通过自噬影响人骨肉瘤细胞的上皮间质转化。