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缺血性脑卒中的发生是由脑部血液供应不足造成的,目前主要的治疗手段是恢复血液再灌注,但是在这一过程中会进一步加重脑组织损伤,这种病理生理改变称为脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。由于其发生机制复杂,近年来对脑I/R损伤的病理生理机制及如何减轻这一损伤成为研究的热点。研究表明,P2X7受体受到抑制时可发挥抗脑I/R损伤的作用,但其作用机制仍需要进一步的研究。线粒体是为细胞提供能量的动态细胞器,在正常状态下处于融合与裂变的平衡之中。但当发生I/R损伤时,其动态平衡会遭到破坏并趋向于裂变,从而加重损伤。研究表明AMP-activated protein kinase(AMPK)可以调节线粒体的融合与裂变,且在酒精性肝病中抑制P2X7受体可以增强AMPK的活性。但在小鼠脑I/R损伤中,抑制P2X7受体与AMPK是否存在相似的作用尚未有文献报导。因此,本研究采用在体和离体两部分实验来探讨AMPK介导的线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗小鼠脑I/R损伤中的作用及具体的作用机制。目的:探讨AMPK介导的线粒体融合与裂变在抑制P2X7受体抗小鼠脑I/R损伤中的作用。方法:1.成年雄性ICR小鼠随机分为假手术(sham)组、脑缺血/再灌注(I/R)组、脑缺血/再灌注+BBG(Bright Blue G,P2X7受体抑制剂;I/R+BBG)组、脑缺血/再灌注+BBG+Dorsomorphin(AMPK抑制剂,I/R+BBG+Dorsomorphin)组。小鼠脑I/R损伤模型参照大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MACO)法制备,缺血1 h,再灌注24 h。小鼠神经行为学进行评分采用Longa五分法评估;采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法检测小鼠脑梗死体积;采用透射电镜(transmission electron microscopy TEM)法检测线粒体的融合与裂变;采用western blot法检测p-AMPK、p-Drp1、Mfn2的蛋白表达。2.体外:从ICR胎鼠脑组织中提取神经元细胞进行培养。制备神经元缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型,并将细胞分为对照(control)组、缺氧/复氧(H/R)组、缺氧/复氧+BBG(H/R+BBG)组、缺氧/复氧+BBG+Dorsomorphin(H/R+BBG+Dorsomorphin)组。采用Calcein-AM双染法检测神经元细胞的存活率;采用活性氧(reactive oxide species,ROS)试剂盒检测各组细胞ROS的含量;采用Mito Tracker TM Green FM试剂盒检测神经元细胞线粒体融合与裂变的情况;采用western blot法检测p-AMPK、p-Drp1、Mfn2的蛋白表达。结果:1.神经行为学结果表明,sham组小鼠行为学评分为0,但其神经行为学评分明显增加当小鼠发生脑I/R损伤时;与I/R组相比,在使用BBG之后,小鼠的神经行为学评分明显降低;但与I/R+BBG组相比,在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后,小鼠的神经行为学评分又明显增加。2.脑梗死体积百分率结果表明,sham组小鼠无脑梗死体积,但当小鼠发生I/R损伤时其脑梗死体积百分率显著增加;与I/R组相比,在使用BBG之后,小鼠的脑梗死体积百分率明显减小;但与I/R+BBG组相比,在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后,小鼠的脑梗死体积百分率又显著增加。3.透射电镜结果表明,当小鼠发生脑I/R损伤时,其大脑皮层组织线粒体的周长、圆度和径长比均降低,而与I/R组相比,在使用BBG之后,小鼠大脑皮层组织线粒体的体周长、圆度和径长比均增加;但与I/R+BBG组相比,在抑制P2X7受体的基础上进一步使用Dorsomorphin抑制AMPK后,小鼠大脑皮层组织中线粒体的体周长、圆度和径长比又均增加。4.Western blot结果显示,与sham组相比,I/R组p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加;与I/R组相比,在使用BBG之后,p-AMPK、Mfn2的表达增加而p-Drp1的表达降低;但与I/R+BBG组相比,在抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后,p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达则增加。5.Calcein-AM双染法结果显示,当神经元发生H/R时死亡率明显增加,与control组相比;但在使用BBG之后,与H/R组相比,神经元细胞死亡率则明显降低;而与H/R+BBG组相比,在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后,神经元细胞死亡率又明显增加。6.ROS检测结果显示,与control组相比,H/R组活性氧含量明显增量,但与H/R组相比,在使用BBG之后,活性氧含量则明显降低;而与H/R+BBG组相比,在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后,活性氧含量又明显增加。7.激光共聚焦显微镜观察结果表明,当发生H/R时,与control组相比,神经元细胞线粒体裂变明显增加而融合减少;但在使用BBG之后,与H/R组相比,神经元细胞线粒体的裂变减少而融合增多;而与H/R+BBG组相比,在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后,神经元细胞线粒体的裂变又明显增多而融合减少。8.Western blot结果显示,与control组相比,H/R组p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加;与H/R组相比,在使用BBG之后,p-AMPK、Mfn2的表达增加而p-Drp1的表达降低;而与H/R+BBG组相比,在使用BBG抑制P2X7受体的基础上进一步抑制AMPK后,p-AMPK、Mfn2的表达降低而p-Drp1的表达增加。结论:1.在小鼠脑I/R损伤中抑制P2X7受体可以抑制线粒体裂变、促进线粒体融合。2.抑制P2X7受体可以通过增加p-AMPK的表达从而减轻小鼠脑I/R损伤。3.抑制P2X7受体可以通过调控AMPK抑制线粒体裂变、促进线粒体融合来减轻小鼠脑I/R损伤。