【摘 要】
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本研究探索并建立基于慢病毒载体精子介导法高效制备生产转基因鸡的技术体系。构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体和慢病毒表达载体,并对293T细胞进行转染分析对
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本研究探索并建立基于慢病毒载体精子介导法高效制备生产转基因鸡的技术体系。构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体和慢病毒表达载体,并对293T细胞进行转染分析对比。用慢病毒感染原代培养细胞鸡生殖细胞和鸡胚小肠上皮细胞,并用实时荧光定量PCR对感染慢病毒的细胞进行目的基因检测。用性成熟公鸡生殖器官组织做切片后,运用微创手术方法,将以绿色荧光蛋白为报告基因的慢病毒载体连续导入性成熟公鸡睾丸,进行精液检查,观察到精子中绿色荧光的表达后,进行人工授精、种蛋孵化,以期在鸡胚和小鸡中检测到目的基因。研究结果：成功构建了以绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达载体PcDNA3.1-GFP和慢病毒表达载体并在293T细胞中表达。用慢病毒感染的细胞进行实时荧光定量PCR检测结果：293T细胞感染复数最高,达6.08×107TU/mL;鸡胚小肠上皮细胞5.36×105TU/mL;鸡胚生殖细胞0.84×102TU/mL。用性成熟公鸡生殖器官组织切片,观察公鸡睾丸实质由细精管组成呈网状,适合睾丸注射。应用微创手术法将慢病毒载体连续导入性成熟公鸡睾丸中,在精子中检测到了绿色荧光,将表达绿色荧光的精子体外授精,授精蛋进行孵化,并在第一代转基因鸡中检测到外源基因绿色荧光蛋白的表达。
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