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研究背景:脂肪移植是整形外科中修复软组织缺损的重要治疗手段,但移植后出现的囊肿、结节等并发症和较低的体积保持率等问题都与脂肪坏死有关。脂肪移植后的脂肪细胞再生既是以往研究中观察到的现象,也是解决脂肪坏死问题的重要途径。脂肪组织中,成熟脂肪细胞再生的主要来源为PDGFRα+前体脂肪细胞,但PDGFRα+前体脂肪细胞的成脂分化如何被调控仍不十分清楚。脂肪移植后的炎症微环境对脂肪再生有着重要影响,而巨噬细胞在炎症反应中扮演关键角色。巨噬细胞的不同亚型即M1和M2巨噬细胞,对PDGFRα+前体脂肪细胞的成脂分化调控可能存在不同的作用。研究目的:本研究分别设计了巨噬细胞上清液与前体脂肪细胞共培养实验、小鼠自体脂肪移植巨噬细胞清除实验,并检测细胞或组织的成脂效果和成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的表达,探讨炎症微环境中M1/M2型巨噬细胞对PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化的影响,明确M1和M2型巨噬细胞分别对PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化的促进或抑制作用。本研究主要从如下几方面进行:1.探讨M1和M2型巨噬细胞分泌炎性因子和发挥作用的差别。2.探讨脂肪移植后,脂肪组织内M1和M2型巨噬细胞出现时机和数量变化趋势。3.明确M1和M2型巨噬细胞对PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化的影响,作用是促进还是抑制。研究方法:体外实验1.体外分离培养小鼠原代骨髓细胞,体外用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激骨髓细胞分化为巨噬细胞,并分别用γ干扰素(IFN-γ)、脂多糖(LPS)和白细胞介素4(IL-4)刺激巨噬细胞极化为M1和M2型巨噬细胞,收集M1和M2型巨噬细胞上清液并用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测其中炎症因子含量。2.体外分离培养小鼠原代脂肪干细胞,从中分选PDGFRα+前体脂肪细胞,并分别于静息状态(非成脂诱导)和激活状态(成脂诱导)下培养扩增,培养同时分别加入M1型或M2型巨噬细胞上清液进行共培养。3.用油红O染色共培养后的PDGFRα+前体脂肪细胞,进行成脂效果的定性分析;用Real-time PCR检测共培养后PDGFRα+前体脂肪细胞的PPARγ和C/EBPα基因表达,用Western blot检测共培养后PDGFRα+前体脂肪细胞的PPARγ和C/EBPα蛋白表达,定量分析PDGFRα+前体脂肪细胞的成脂效果。体内实验1.对小鼠行自体脂肪移植术,将小鼠的腹股沟脂肪移植于同一只小鼠的背部。2.分别于术后第0、4、11、13、1625、30天取材,进行流式细胞检测移植物中M1和M2巨噬细胞占总细胞含量比例并绘制随时间含量变化曲线。3.再次对小鼠行自体脂肪移植术,于部分小鼠背部脂肪移植物内注射氯化钆(GdCl3),选择性清除移植物内的M1巨噬细胞;于部分小鼠背部脂肪移植物内注射氯膦酸二钠脂质体(m-Clodrosome(?)),选择性清除移植物内M2巨噬细胞;两组实验均设置相应的对照组。移植物内药物注射每周2次,持续8周后取材。4.对脂肪组织标本进行围脂滴蛋白(Perilipin)免疫组化染色,定性评价成脂效果;用Real-time PCR检测脂肪组织的PPARγ和C/EBPα基因表达,用Western blot检测脂肪组织的PPARγ和C/EBPα蛋白表达,定量分析移植物成脂效果。研究结果:体外实验1.M1型和M2型巨噬细胞上清液所含炎性因子含量有较大差别,M1型巨噬细胞上清液中促炎因子(TNF-α、iNOS、IL-12)含量明显高于M2型巨噬细胞,而M2型巨噬细胞上清液中抗炎及促生长因子(IL～10、TGF-β1)含量明显高于M1型巨噬细胞。2.PDGFRα+前体脂肪细胞静息状态下(无成脂诱导)巨噬细胞对其成脂分化无明显影响,而在活化状态下(成脂诱导)M1型巨噬细胞能明显抑制PDGFRα+前体脂肪细胞成脂分化,M2型巨噬细胞未表现出抑制或促进作用。体内实验1.小鼠自体脂肪移植后移植物内M1型巨噬细胞早期含量上升后期下降,M2型巨噬细胞早期维持在较低水平,后期含量逐渐上升。2.选择性清除脂肪移植物内M1型巨噬细胞后,移植物成脂明显增加,而选择性清除移植物内M2型巨噬细胞后移植物的成脂没有发生明显变化。研究结论:1.M1型和M2型巨噬细胞主要分泌不同炎症因子,发挥了不同的功能,M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子,而M2型巨噬细胞主要分泌抗炎及促生长因子。2.脂肪移植后巨噬细胞的浸润早期以M1型巨噬细胞为主,后期以M2型巨噬细胞为主。3.巨噬细胞可以直接影响前体脂肪细胞的成脂分化,并且M1/M2型巨噬细胞发挥了不同作用:M1型巨噬细胞可以显著抑制脂肪组织内前体脂肪细胞的成脂分化,M2型巨噬细胞对前体脂肪细胞成脂分化无明显影响。