硫化氢对大鼠肾脏水钠排泄的作用及其机制

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硫化氢(Hydrogen Sulfide, H2S)是一种无色有臭鸡蛋味的气体,过去一直被认为是毒性气体。但是,近年来研究发现多种哺乳动物细胞自身能产生H2S,在正常大鼠的血液中H2S浓度达到46μmol/L,在脑中H2S浓度高达100μmol/L。内源性H2S主要由胱硫醚-p-合酶(Cystathionine β-synthase, CBS)或胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine γ-lyase, CSE)分解L-半胱氨酸产生。CBS主要存在于神经系统中,而CSE主要存在于心血管系统中。内源性H2S对神经系统、心血管系统、消化系统和呼吸系统均有重要的生理调节功能。由于H2S是一种小分子量的气体分子,能穿透细胞膜直接起效,在体内产生并受内源性关键酶的调节,生理浓度时有明确的功能并能被外源性气体模拟,因此,H2S成为继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三个气体信号分子。H2S在正常血压的维持和调节方面起着重要的作用。研究显示,内源性H2S水平的降低与高血压的形成有密切关系,而给予补充外源性H2S有降压效果,能缓解高血压的进程。肾脏是参与整体血压调节的重要器官,它具有调节机体水钠平衡的功能,对正常血压的维持和调节有着重要意义。当肾脏的水钠重吸收功能发生障碍时,机体的血压会明显升高。近年来,盐与高血压的密切关系已逐渐引起人们的重视。高盐的摄入会影响正常生理状态下钠的动态平衡,会直接导致肾脏水钠潴留,引起高血压。由此可见,肾脏水钠排泄障碍和水钠潴留是高血压形成的重要机制,多年来排钠利尿剂也已成为临床上治疗高血压病的有效药物,因此,研究肾脏水钠排泄的调节具有重要的临床应用价值。在肾脏组织中,含有丰富的催化内源性H2S产生的酶CBS和CSE,它们主要位于肾皮质近端小管。而肾脏调节水钠排泄的主要部位就在肾皮质近端小管,已知约有70%的水和钠是在近端小管被重吸收的,因此提出H2S有可能影响肾脏水钠排泄的设想。然而目前H2S在肾脏组织中的生理功能还不十分清楚,仅在2009年有一篇文献报道H2S可能参与肾组织血流动力学和排泄方面的功能调节。因此,本文通过对H2S在肾脏水钠排泄方面的研究,将更深入地认识这个新的气体信号分子。首先,观察H2S对正常SD大鼠肾脏水钠排泄的作用。实验中,使用硫氢化钠(NaHS)作为H2S的供体,选择一分钟匀速静脉注射的方式,尽量保持平均动脉压(MAP)和肾动脉血流量(RBF)的稳定,使其不会直接影响肾脏水钠排泄的作用。给予正常SD大鼠一分钟匀速静脉注射20μmol/kg的NaHS,检测其尿量(UV)、排钠量(UNaV)、排钾量(UKV)和排氯量(UClN),结果显示H2S能促进正常SD大鼠的肾脏排钠排钾,且不伴有肾血流量的改变。其次,观察H2S对盐负荷大鼠肾脏水钠排泄的作用。通过建立急性盐负荷和慢性盐负荷两种大鼠模型,研究在病理状态下,H2S能否促进水钠排泄,并缓解高血压的形成。给予SD大鼠匀速静脉注射5%NaCl溶液1小时,建立急性盐负荷大鼠模型,接着一分钟匀速静脉注射不同浓度NaHS (5,10,20,30,60, 90μmol/kg),观察H2S对其血流动力学和排泄方面的影响。结果显示H2S对MAP、RBF和肾小球滤过率(GFR)等血流动力学方面没有影响,而在排泄方面,10和20μmol/kg的NaHS能促进急性盐负荷大鼠肾脏排钠、排钾和排氯,对尿量没有影响。之后进一步检测了血浆醛固酮(ALD)和抗利尿激素(ADH)的水平,结果显示H2S对这两种激素的水平没有影响。然后,通过皮下注射醋酸脱氧皮质酮(DOCA)和饲饮盐水的方法,建立DOCA-Salt高血压大鼠(DHR)模型作为慢性盐负荷大鼠模型。在造模的同时,预防性(即在血压没有升高之前)的给予大鼠腹腔注射不同浓度NaHS (10、30、 60μmol/kg/d)8周,观察H2S对其MAP和排泄方面的影响。结果显示,8周时,H2S能使MAP升高的幅度降低,缓解高血压的形成;而10μmol/kg的NaHS在4周时能促进慢性盐负荷大鼠肾脏排水、排钠、排钾和排氯。之后同样检测第4周时慢性盐负荷大鼠血浆ALD和ADH的水平,结果显示H2S对这两种激素没有影响。上述实验结果说明H2S能促进盐负荷大鼠肾脏的水钠排泄,且不伴有肾血流量、肾小球滤过率和血浆ALD、ADH的改变,提示H2S促进肾脏水钠排泄的作用部位很可能在肾小管。而在肾小管上影响水钠重吸收的是离子转运体,其中最主要的就是钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase,Na+泵)。因此,通过分离慢性盐负荷大鼠的肾小管上皮细胞和检测Na+-K+-ATPase的活性,发现H2S能抑制慢性盐负荷大鼠肾小管上皮细胞膜Na+-K+-ATPase的活性。推测H2S通过直接抑制肾小管上皮细胞膜Na+-K+-ATPase的活性,抑制肾小管对Na+的重吸收,从而产生促进水钠排泄的作用。此机制有待于在细胞水平上进行验证。另外,通过比较H2S促进正常SD大鼠和急慢性盐负荷大鼠肾脏排钠排钾作用的差别,发现H2S在病理状态下,促进排钠排钾的作用更强,具有一定的临床意义。为了进一步探讨H2S促进大鼠肾脏水钠排泄的作用机制,本文通过分离大鼠肾小管上皮细胞作原代培养,研究H2S是否可直接调节肾小管上皮细胞的钠转运功能。实验结果表明给予NaHHS可直接抑制肾小管上皮细胞膜Na+-K+-ATPase的活性,印证了本文前面的推测,即H2S可直接抑制肾小管上皮细胞膜Na+泵的功能,抑制肾小管对Na+的重吸收,从而产生排钠利尿作用。那么,H2S是如何抑制肾小管上皮细胞膜Na+-K+-ATPase的呢?通过检测细胞cAMP、cGMP、PKA和PKC的活性以及PKA和PKC的磷酸化水平,发现H2S对它们没有影响。之后Western blot结果显示H2S能促进细胞内信号分子PI3K和Akt的磷酸化,并具有时间和浓度依赖性,用PI3K的阻断剂LY294002和wortmannin能够阻断H2S引起的Akt磷酸化。预先给予细胞PI3K的阻断剂或者用显性负表达的Akt质粒(DN-Akt)转染细胞,H2S抑制Na+-K+-ATPase的效应被阻断,说明H2S抑制细胞膜Na+-K+-ATPase的效应可能通过PI3K/Akt通路。进一步研究发现,H2S既能使Na+-K+-ATPase α1亚基发生酪氨酸磷酸化(Tyr10),也能使ERIK的磷酸化水平增加,提示Na+泵α1亚基和ERK也可能参与H2S对细胞膜Na+-K+-ATPase的调控。最后,研究H2S除了细胞信号转导作用之外,是否有可能直接与Na+-K+-ATPase结合而发挥其调节作用呢?选用纯化的Na+-K+-ATPase与NaHS直接反应,结果显示,H2S能提高纯化Na+-K+-ATPase的活性,并且这种效应具有时间和浓度的依赖性,考虑可能的原因是纯化Na+-K+-ATPase的组织差异、种属差异以及构象的改变。为了进一步探索H2S与Na+-K+-ATPase之间的相互作用,本文通过AutoDock软件对H2S与Na+-K+-ATPase进行分子对接研究。结果显示,H2S与Na+-K+-ATPase可能有3个结合位点,其中已知的是K+结合位点,提示H2S可能通过影响K+与Na+-K+-ATPase的结合而调节Na+泵功能。综上所述,本文通过上述一系列实验发现H2S能促进正常SD大鼠和盐负荷大鼠肾脏的水钠排泄;H2S促进水钠排泄的作用是通过抑制肾小管上皮细胞膜Na+-K+-ATPase来完成的;H2S抑制肾小管上皮细胞膜Na+-K+-ATPase的活性可能与激活细胞PI3K/Akt信号通路有关。
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