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背景与目的:急性肺栓塞（APE）的血栓80%左右来自下肢深静脉血栓（DVT）的脱落,少部分来源于右心系统,极少部分为肺动脉原位的血栓形成。血管内皮的损伤、血流淤滞和高凝状态是血栓形成的基本条件。任何来源的血栓导致的病理生理改变以及相关的临床征象均为肺动脉部分或全部闭塞造成的血流部分或全部中断所致。血管的闭塞既导致了机体的缺血缺氧,神经-体液的激活以及循环内分泌因子的大量释放,也导致了肺微血管内皮细胞（PMVECs）的损伤和功能障碍。线粒体在维持内皮细胞稳定性中发挥重要作用,线粒体的损伤程度与细胞损伤和凋亡密切相关。多年来抗凝治疗始终作为肺循环血运重建的首选方法并获得了很好的疗效。但是,APE发生后PMVECs中的线粒体发生了怎样的损伤,抗凝药物的作用是否仅仅局限在血管的再通,对于线粒体功能的修复起到了怎样的作用少有研究。由于APE已经成为心血管系统高发病和高死亡的疾病,近年来新型口服抗凝药物（NOACs）不断开始应用于临床。达比加群作为凝血通路中的单靶点抑制剂,特异性的与凝血酶结合,其口服剂型快速吸收达到稳定血药浓度,与食物和药物少有影响,无需监测凝血常规和较低的出血风险,具有很好的抑制血栓形成和辅助纤溶系统发挥溶解血栓的作用。由于达比加群具有较好的恢复肺血管血流的作用,国内外多部指南将其口服剂型达比加群酯列为治疗APE的一线推荐,同时也使得一些学者开始关注达比加群对闭塞的PMVECs和线粒体损伤的是否有修复作用,相关研究结果尚未见报道。本研究通过建立小鼠PMVECs的氧糖剥夺（OGD）模型,在细胞水平上模拟缺血/低氧致小鼠PMVECs和线粒体损伤,观察不同浓度达比加群对PMVECs以及线粒体损伤的作用,探讨其抗凝作用以外的肺血管保护作用及机制。研究方法:采用酶消化法分离并培养出小鼠PMVECs,使用倒置相差显微镜观察PMVECs的形态,流式细胞术及免疫荧光鉴定PMVECs,其后应用PMVECs构建OGD模型并且进行如下研究:（1）达比加群对PMVECs增殖、周期和凋亡的影响PMVECs构建OGD模型成功后,分别用10nM、100nM、300nM浓度的达比加群对PMVECs分别进行6h、24h和72h的培养同时设立对照组。采用CCK-8法评价PMVECs的增殖活性,免疫荧光染色评价PMVECs细胞凋亡形态,流式细胞术评价PMVECs细胞周期和PMVECs细胞凋亡率。（2）达比加群对PMVECs炎性细胞因子释放和线粒体损伤的影响①分别采用Elisa和RT-PCR检测对照组、OGD组和达比加群组处理PMVECs 24h后炎性细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、PAF、TGF-β、TXA2的浓度变化及mRNA表达水平。②采用流式细胞仪检测了达比加群对DCFH-DA荧光探针标记的线粒体活性氧（mtROS）的影响和JC-1标记的线粒体膜电位（MMP）的变化;应用检测ATP、乳酸以及葡萄糖摄取水平的测试盒检测达比加群对PMVECs线粒体合成ATP、乳酸生成以及葡萄糖摄取水平的变化。③采用Mito-Tracker Green染色观察三组PMVECs线粒体形态变化;利用透射电镜观察三组PMVECs线粒体超微结构的变化;用Western blot评价三组PMVECs线粒体动力学变化。④应用Western blot检测三组线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9和Cyt-c蛋白的表达情况。（3）达比加群对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响及其在PMVECs线粒体损伤修复中的作用通过Western blot检测三组PI3K/AKT/mTOR信号通路中关键蛋白p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表达情况。研究结果:（1）达比加群对PMVECs增殖、周期和凋亡的影响①达比加群能显著提高OGD时PMVECs的增殖率与对照组相比,OGD组和三种不同浓度的达比加群组在6h、24h和72h均使PMVECs的增殖率明显下降（P<0.05）;与OGD组相比,三种不同浓度的达比加群在6h、24h和72h均使PMVECs组的细胞增殖率明显上升（P<0.05）。并选取24h细胞进行后续实验。②达比加群通过促进PMVECs由G0/G1期向S期及G2/M期转化,加速PMVECs的DNA合成与对照组相比,OGD组和达比加群组中G0/G1期比例明显提高（P<0.05）,S期比例明显下降（P<0.05）,G2/M期比例呈下降趋势;与OGD组相比,达比加群组G0/G1期比例明显下降（P<0.05）,S期比例明显提高（P<0.05）,G2/M期比例呈提高趋势,且呈剂量依赖。③达比加群能够抑制OGD诱导的PMVECs凋亡对照组细胞染色淡且均匀,OGD模型组细胞颜色较浓,细胞核染色质固缩明显,形态不规则,达比加群组随着药物浓度增高,细胞颜色由深变浅,染色质凝集程度逐渐降低,细胞核形态趋于规则。与对照组相比,OGD组及达比加群组细胞凋亡率显著增多（P<0.05）;达比加群组细胞凋亡率较OGD组明显减少（P<0.05）,并且随着达比加群浓度升高细胞凋亡率减少更明显（P<0.05）。（2）达比加群对PMVECs炎性细胞因子释放和线粒体损伤的影响①达比加群能抑制OGD诱导的PMVECs炎性细胞因子释放OGD组及达比加群组PMVECs IL-1、IL-6、IL-8、PAF、TGF-β、TXA2的释放水平较对照组明显升高（P<0.05）;达比加群组上述炎性细胞因子水平较OGD组降低,且呈浓度依赖,但300 nM达比加群组与100 nM达比加群组相比IL-1水平无统计学差异。OGD组及达比加群组上述炎性细胞因子mRNA表达水平较对照组增多,但100 nM达比加群组的IL-8及300 nM达比加群组各炎性细胞因子mRNA的表达水平与对照组相比无统计学差异;达比加群组上述炎性细胞因子的mRNA表达水平较OGD组降低,呈浓度依赖,但10 nM达比加群组的IL-8mRNA的表达水平与OGD组相比无统计学差异,300 nM达比加群组的IL-8及TXA2mRNA的表达水平与100 nM达比加群组相比无统计学差异。②达比加群通过抑制OGD时PMVECs mtROS的产生,进而提高PMVECs的MMP水平,促使线粒体合成ATP功能的恢复,使细胞乳酸内水平下降、葡萄糖摄取水平提高与对照组相比,OGD组及达比加群组DCF平均荧光强度显著增强（P<0.05）;而达比加群组较OGD组DCF平均荧光强度显著减弱（P<0.05）。在对照组中,JC-1以聚合物的形式聚集在PMVECs线粒体基质中,呈现红色荧光,为正常MMP表现;而OGD组及达比加群组发红色荧光的PMVECs比例明显下降（P<0.05）即MMP明显降低,其中经OGD处理后PMVECs线粒体内红色荧光最少、绿色荧光最多即OGD组PMVECs MMP最低;与OGD组相比,达比加群组发红色荧光的PMVECs比例明显增多（P<0.05）,且呈浓度依赖性（P<0.05）,说明MMP逐渐提高。与对照组相比,OGD组及达比加群组PMVECs线粒体合成ATP水平明显降低（P<0.05）、生成乳酸水平明显升高（P<0.05）、葡萄糖摄取水平明显降低（P<0.05）;而达比加群组较OGD组PMVECs线粒体合成ATP水平明显升高（P<0.05）、生成乳酸水平明显降低（P<0.05）、葡萄糖摄取水平明显升高（P<0.05）,且呈浓度依赖性（P<0.05）。③达比加群能明显改善PMVECs线粒体的形态及超微结构,促使线粒体形态及超微结构趋于正常化,抑制OGD诱导的线粒体裂变,促进线粒体融合通过倒置荧光显微镜观察到PMVECs细胞核被DAPI染为蓝色,线粒体被Mito-Tracker Green染为绿色,Merge染色中蓝色的细胞核被绿色的线粒体包围。对照组中细胞核体积最大,线粒体数目最多,OGD组中细胞核体积最小,线粒体数较少且形态模糊不规则,达比加群组随着剂量增加表现出细胞核体积增大,线粒体数目增多,形态趋于清晰且规整。透射电镜下观察对照组PMVECs线粒体呈椭圆形或棒状结构,线粒体内嵴整齐,嵴内腔未见扩张。OGD组PMVECs线粒体肿胀变形呈球状结构,内嵴减少,部分空泡化。三种浓度达比加群组随着剂量增加表现出PMVECs线粒体肿胀变形程度较小,椭圆形或棒状结构增加,小球状结构减少,线粒体嵴趋于增多,空泡化明显减少。与对照组相比,OGD组及达比加群组线粒体裂变相关蛋白p-DRP1（s637）及融合相关蛋白OPA1表达水平明显降低（P<0.05）,线粒体裂变相关蛋白DRP1及p-DRP1（s616）表达水平均明显升高（P<0.05）;与OGD组相比,达比加群组p-DRP1（s637）及OPA1表达水平明显升高（P<0.05）,DRP1及p-DRP1（s616）表达水平均明显降低（P<0.05）,呈浓度依赖性（P<0.05）。④达比加群对PMVECs线粒体凋亡相关蛋白表达的影响与对照组相比,OGD组和达比加群组促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9和Cyt-c蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显降低（P<0.05）;与OGD组相比,达比加群组促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 9和Cyt-c表达水平均明显降低（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显升高（P<0.05）,且呈浓度依赖（P<0.05）。（3）达比加群对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响及其在PMVECs线粒体损伤修复中的作用达比加群激活了PI3K/AKT/mTOR通路促进PMVECs线粒体损伤的修复与对照组相比,OGD组及达比加群组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达水平均明显降低（P<0.05）;与OGD组相比,达比加群组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白的表达水平均明显升高（P<0.05）,且呈浓度依赖性（P<0.05）。研究结论:（1）达比加群可能通过提高OGD模拟APE的小鼠PMVECs的细胞增殖活性、促进细胞DNA合成并抑制细胞凋亡发挥对PMVECs的保护作用。（2）达比加群可能通过抑制OGD模拟APE的小鼠PMVECs炎症反应介导的mtROS途径促进PMVECs线粒体功能、形态和结构损伤的恢复,抑制PMVECs线粒体凋亡。（3）达比加群可能进一步通过激活OGD模拟APE的小鼠PMVECs内PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制mtROS的产生,从而促进PMVECs线粒体损伤的修复。（4）达比加群在治疗APE时除了通过抑制凝血途径的Ⅱ因子发挥抗凝作用外,可能对肺微小血管内皮细胞具有保护作用。