肥胖是能量摄入长期超过能量消耗的结果。针对肥胖的传统治疗并不能为大多数患者提供令人满意的长期效果。在人类成年后功能性棕色脂肪组织仍然存在被证实后,人们致力于使脂肪积累的白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)转化为耗能的棕色脂肪组织(Brown adipose tissue,BAT)从而开发以脂肪组织本身为基础的疗法。在过去的十年中,针对BAT的肥胖症治疗的研究日益增加。日前已确定两种类型的脂肪组织:白色脂肪组织和棕色脂肪组织。其中,白色脂肪储存能量(甘油三酯),棕色脂肪组织产生热量并消耗能量。白色脂肪组织细胞较大,包含较大的单个脂滴(主要化学成分为甘油三酯),线粒体较少。棕色脂肪组织细胞较小,包含多个脂滴,具有大量的线粒体,并且高度表达解偶联蛋白1(uncoupled protein 1,UCP1)。因此,棕色脂肪组织可以消耗能量并产生热量。后来发现,在人和小鼠中存在不同于BAT和WAT的米色脂肪组织(beige adipose tissue,bAT),这种脂肪组织在形态、功能、表达的基因以及对外界刺激的反应层面上都有很大的不同。米色脂肪细胞的形态、功能以及线粒体数量都介于白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞之间。线粒体的生物形成是细胞中线粒体数量增加的过程。在此过程中,线粒体所需的蛋白质组成非常重要,例如线粒体DNA聚合酶γ(DNA polymerase gamma,polg)等。此外线粒体的增殖受许多因子的调节,例如过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1 α(PGC-1 α),它是线粒体增殖的主要调控因子。线粒体DNA聚合酶(polg)和PGC-1α被认为是线粒体生物形成的关键分子。当然,其他一些基因产物在线粒体的生物发生过程中也起着重要作用,例如参与线粒体结构功能的各种蛋白分子。鸢尾素(irisin),是骨骼肌分泌的一种激素,随运动分泌增多,是一种小型多肽激素,含有111个氨基酸,分子量大约为22kDa,由纤维连结蛋白Ⅲ型域包含蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain containing 5,Fndc5)在第 30 和 140 位氨基酸处水解生成。鸢尾素最初作为PGC1-α依赖性肌动蛋白被发现,是一种内分泌分子,可以通过刺激UCP1表达,将白色脂肪组织转化为棕色脂肪组织。其发现使它成为白色脂肪转化中的明星分子,为抗击肥胖提供了希望。但鸢尾素介导白色脂肪变成米色脂肪的分子机制仍不清楚。米色脂肪的转化需要两个条件:一是UCP1的诱导表达,它用于消耗能量和脂肪。二是线粒体生物发生过程的促进或线粒体数目的增加。因此,我们假设鸢尾素作用于骨骼肌细胞,然后作用于脂肪细胞,增加线粒体生物发生或促进线粒体生物发生,从而产生米色脂肪细胞。本研究的主要目的是探讨外源性鸢尾素是否能增加已分化的3T3L1脂肪细胞的线粒体含量以及在褐变过程中线粒体的生物发生。研究方法小鼠3T3-L1前脂肪细胞是成熟的细胞系,通常用于体外研究脂肪细胞的分化。1简要来说,使用常规基础培养基在5%C02培养箱中37℃培养前体脂肪细胞。细胞融合后,使用诱导培养基诱导细胞向脂肪细胞分化。诱导分化2天后(在第2天),将培养基更换为仅添加胰岛素的基础培养基,继续培养2天。在第4天,将培养基更换为基础培养基,培养两天。在脂肪细胞分化第4天,在3T3-L1细胞中加入鸢尾素(irisin),共刺激4天。第8天,分别对3T3-L1成熟脂肪细胞进行有或无鸢尾素处理,油红0染色确认脂肪细胞分化,western blotting验证棕色脂肪细胞特异性基因的表达。2提取RNA或蛋白,进行逆转录定量PCR(RT-qPCR)和Western blot检测线粒体DNA聚合酶(polg)、PGC-1a等线粒体相关基因在mRNA和蛋白质水平的改变。3观察鸢尾素线粒体染色处理后的脂肪细胞形态是否发生改变。研究结果1.诱导分化3T3-L1前体脂肪细胞为成熟脂肪细胞,油红O染色可见明显脂滴。2.逆转录-定量PCR和western blot结果显示,分化的脂肪细胞经鸢尾素处理后,与线粒体生物形成密切相关的两个基因[线粒体DNA聚合酶(polg)和PGC-1 α表达]的表达在mRNA和蛋白质水平上都有显著提升,鸢尾素还增强了另一个线粒体形成相关基因的表达。3.线粒体染色显示,与未加鸢尾素的细胞相比,使用鸢尾素处理的细胞中,鸢尾素增加了线粒体数量。结论1.鸢尾素通过明显促进分化的3T3L1脂肪细胞线粒体生物发生的PGC-1 α和polg(聚合酶(DNA定向)γ)两个分子的表达来提升白色脂肪细胞的线粒体的生物形成。2.鸢尾素促进白脂肪细胞的线粒体数目的提升,从而为白色脂肪的米色化发展提供形态变化的基础。3.总之,鸢尾素通过促进白色脂肪细胞线粒体的生物形成、数量增加,而具有促进白色脂肪米色化的潜在能力。