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鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）是一种具有高度传染性的能够引起鸡慢性呼吸道疾病的病原体，感染鸡主要表现为咳嗽、喷嚏、气管罗音和鼻炎，给我国的养禽业造成了严重的经济损失。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是诊断MG感染的一种常用的血清学检测方法，目前国内还没有商品化的MG抗体ELISA检测试剂盒，在我国开展的MG血清学检测中通常使用进口试剂盒，但其检测成本很高、不适合大范围推广应用，这给我国MG的防控带来困难。因此，研究具有自主知识产权的MG抗体ELISA诊断试剂盒可为我国MG的流行病学监测及净化提供有效的诊断工具。 在本实验室前期的研究基础之上，初步筛选出属于粘附素蛋白和热休克蛋白家族的五种脂质相关膜蛋白即P25、P33、P37、P60和P44。利用原核表达系统将其进行表达纯化，用多份MG阳性血清进行Westem blot分析，结果显示属于热休克蛋白家族的重组蛋白P60(rP60)与MG的阳性血清发生较强的特异性免疫反应，表明rP60具有较好的反应原性。 将纯化的rP60作为包被抗原，建立rP60-iELISA方法，分别对抗原包被浓度、血清稀释倍数及作用时间、封闭液的选择及封闭条件、二抗稀释倍数及作用时间、cut-off值等反应条件进行优化，确定ELISA最适工作条件为抗原的包被浓度为2.5μg/mL;血清样品1∶80稀释37℃作用60mm;5％的脱脂乳37℃封闭2h，酶标二抗1∶10000稀释37℃作用30mm;TMB室温显色10mm;最适的cut-off值为032。为了评估rP60是否具有开发为试剂盒的潜力，对该方法的敏感性、特异性、重复性、准确性及其与商品化试剂盒的符合率、抗体持续期监测及保存期等性能进行评估，结果显示:该方法的敏感性为98％，最低检出上限为血清样品1280倍稀释;特异性为98％，与滑液支原体等几种常见的鸡源性呼吸道疾病的阳性血清无交叉反应;重复性试验结果表明，rP60-iELISA批内变异为1.54％～5.15％，批间变异系数为2.83％～5.98％，对8只疑似MG感染的临床样品进行病原学、分子生物学和血清学进行综合诊断，rP60-iELISA的检测结果与分离培养结果最接近;对临床收集的208份血清样品用rP60-ELISA和商品化试剂盒同时进行检测，两者总符合率为87.8％;rP60-iELISA最早可在鸡免疫疫苗后1周监测到MG抗体，与商品化试剂盒相比，该方法更适合早期检测，组装的试剂盒在4℃下保存8个月内，各试剂性状稳定，灵敏性和交叉反应检测结果变异系数均小于10％。上述结果表明，依据MG抗体间接ELISA方法组装的试剂盒，具有良好的敏感性、特异性、准确性、重复性和稳定性，有望为临床MG感染的诊断和防控净化提供一种准确、简便的检测工具。