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虽然经典遗传操作工具在少数模式细菌中有着很好的效果,但并不适用于大多数重要病原菌在内的其它细菌。新型基因编辑技术CRISPR/Cas9由于存在表达元件复杂、脱靶效率高以及细菌存在抗Cas9分子等因素,限制了该技术在很多病原菌中的应用。因此,开发通用、简便、高效、无痕的遗传操作工具对于病原菌致病机制和防控技术的研究具有重要的价值和意义。多杀性巴氏杆菌对猪、牛、鸡、鸭等畜禽养殖业危害严重,缺乏高效的遗传操作工具极大限制了该病原菌致病机理的研究及防控产品的研发。为了研究禽多杀性巴氏杆菌的致病机理和基因工程疫苗,我们实验室前期应用多种经典遗传操作系统,如温敏自杀系统、Sac B筛选系统、galk筛选系统及thy A筛选系统等,来构建禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株但都未成功。后来采用NgAgo/gDNA系统成功实现了禽多杀性巴氏杆菌和兔多杀性巴氏杆菌靶基因的敲除和敲入,并获得了毒力下降的疫苗候选菌株,说明NgAgo/gDNA系统为多杀性巴氏杆菌致病机制和防控产品的研究提供了遗传操作工具,但该系统介导细菌基因组编辑的分子机制并不清楚。鉴于此,本论文主要研究原核生物Argonaute(pAgo)蛋白介导多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌基因敲除及其分子机制,其研究内容如下:1)NgAgo介导不同细菌靶基因的敲除及敲入。我们实验室前期研究发现NgAgo/gDNA系统可以高效介导多杀性巴氏杆菌基因的敲除及敲入,但该系统能否用于其它细菌基因敲除需要进一步研究。本研究发现NgAgo/gDNA系统成功介导大肠杆菌aste基因缺失的效率高达90%。表明NgAgo/gDNA系统可以应用于多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌等细菌的基因敲除。2)NgAgo介导细菌基因敲除不依赖自身的DNA酶活性。CRISPR/Cas9系统可通过g RNA靶向切割基因组DNA而提高同源重组效应,来实现细菌基因组编辑,NgAgo/gDNA系统介导细菌基因敲除是否同样依赖gDNA靶向切割基因组DNA的水解酶活性需要进一步探究。故本论文将NgAgo潜在的酶活性位点(D633A,D738A)进行突变,发现仍能高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi基因敲除。不引入外源gDNA,NgAgo也可以高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi及opa基因的敲除。表明NgAgo提高细菌基因敲除的效率不依赖自身DNA酶活性及外源gDNA。3)NgAgo蛋白通过增强recA介导同源DNA链交换来提高同源重组效率。既然NgAgo介导细菌基因敲除不依赖其自身DNA酶活性及外源gDNA,其机制有待解析。本论文采用IP方法筛选NgAgo蛋白互作分子并通过质谱鉴定同源重组酶recA为其互作蛋白,随后通过正反向Co-IP验证NgAgo与内源性recA互作,且互作不受DNase I处理的影响。通过分析纯化的重组NgAgo蛋白和recA蛋白之间的互作,发现两种蛋白可直接互作,进一步应用SPR技术发现NgAgo与recA互作亲和力高于10n M,暗示recA为NgAgo的互作蛋白。同源重组过程中recA通过与单链DNA结合,并介导单链DNA与同源DNA的链交换而实现同源重组。本论文研究发现NgAgo蛋白并没有显著增加recA蛋白与单链DNA的结合,但却能显著增强recA介导的同源DNA链交换能力。表明NgAgo介导细菌基因敲除的机制是NgAgo蛋白与同源重组酶recA结合,并增强recA介导的同源DNA链交换能力,从而提高了同源重组效率,实现了细菌基因组编辑。4)PIWI结构域是NgAgo蛋白介导细菌基因组编辑的主要结构域。NgAgo蛋白主要由四个结构域构成,即N端、PAZ、MID及PIWI结构域,为了分析NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域,将NgAgo分段为NgAgo-A(N端)、B(PAZ-MID-PIWI区域)、C(N-PAZ区域)、D(MID-PIWI区域)。发现NgAgo-A和NgAgo-C不能,而NgAgo-B和NgAgo-D能与recA互作且高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi基因的敲除。说明NgAgo蛋白C端是其介导细菌基因组编辑的主要结构域。为了排除C端PIWI结构域的DNA酶活性,本论文将NgAgo-D蛋白的酶活性位点进行突变,发现其仍能和recA互作,增强recA介导的同源DNA链交换能力,提高同源重组效率来介导禽多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌基因的敲除。表明NgAgo蛋白C端是其介导细菌基因组编辑的主要区域,且不依赖于自身DNA水解酶活性。为了进一步分析NgAgo介导细菌基因组编辑的主要结构域是MID或PIWI,故将NgAgo分段为NgAgo-E(MID)和NgAgo-F(PIWI),发现PIWI是与recA互作且高效介导禽多杀性巴氏杆菌opa基因敲除的主要结构域。表明PIWI结构域是NgAgo蛋白介导基因组编辑的主要结构域,且不依赖于自身DNA水解酶活性。5)多种pAgo蛋白均能高效介导细菌基因敲除且不依赖其DNA酶活性。NgAgo蛋白可以通过PIWI结构域与recA互作,增强recA介导的同源重组效率来介导细菌基因组编辑,本论文进一步分析了其它原核生物Ago蛋白PIWI结构域的功能保守性。对嗜热栖热菌的Tt Ago、嗜热古细菌的Pf Ago及超嗜热菌的Aa Ago进行分析,发现三种pAgo(MID-PIWI区域)蛋白都能与细菌recA蛋白互作,能高效介导禽多杀性巴氏杆菌lyi及opa基因的敲除,且不依赖于PIWI区域的DNA酶活性。表明不同原核生物Ago蛋白的PIWI结构域具有功能保守性,均可介导细菌的基因组编辑。总之,本研究发现具有PIWI结构域的pAgo蛋白都能介导多杀性巴氏杆菌和大肠杆菌的基因组编辑,其机制是不依赖于gDNA靶向切割基因组DNA的水解酶活性,而是pAgo的PIWI结构域与recA互作,增强recA介导的同源DNA链交换能力,从而提高同源重组效率。pAgo具有开发为通用、简便、高效、无痕的细菌基因组编辑工具的潜力,为研究重要病原菌的致病机理及防控产品等方面奠定了基础。