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Apigenin对人乳腺癌细胞VEGF表达的影响及相关作用通路目的乳腺癌是女性主要恶性肿瘤之一，有易复发和多途径转移的特性。虽然，对参与乳腺癌进展的机制并不完全清楚，但越来越多的对于一些自分泌和旁分泌的因子对于乳腺癌发生、发展的作用的研究表明，在乳腺癌的发展过程中，血管内皮生长因子（VEGF）发挥重要作用。抑制VEGF在肿瘤血管生成及生长中的作用已成为乳腺癌治疗的一个重要靶点。低氧诱导因子（HIF-1）是细胞应激缺氧所产生的转录激活因子。HIF-1在人类许多肿瘤中都高表达，HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位构成的异质二聚体，其中α亚单位受氧浓度的调节。近来又有研究表明，HIF-1α不单纯受氧浓度的调节。癌基因的突变，如VHL，P53或PTEN功能的缺失，都能诱导HIF-1α的表达。生长因子，细胞因子及其他信号分子都能通过激活PI3K／AKT或MAPK途径而刺激HIF-1α的合成。P13K是一个异二聚体酶，AKT是目前研究较为清楚的下游靶点，传递来自生长因子的生存信号。近来有研究表明VEGF的表达是生长因子的刺激和癌基因的激活通过PI3K／AKT信号传导途径作用于HIF-1α而实现的。Apigenin作为一种有益健康的食物提取物，最近又发现它的抗肿瘤作用，然而其机制尚未明确。在乳腺癌中，PI3K的催化亚单位p110α成倍增高，且P13K催化亚单位的表达与VEGF的表达呈正相关。VEGF和HIF-1α在乳腺癌中都有表达，且VEGF表达与HIF-1α的表达相关，表明在乳腺癌中，HIF-1α导致VEGF的高表达。本研究中使用人乳腺癌MDA-MB-231细胞，对Apigenin的抗肿瘤机制进行了研究，并发现Apigenin明显抑制了MDA-MB-231细胞VEGF与HIF-1α的表达，因此，我们对Apigenin抑制VEGF产生的可能机制进行了研究。方法1、应用酶联免疫吸附法检测VEGF在MDA-MB-231细胞中的分泌水平收集经Apigenin处理（15h）或未处理的该细胞无血清培养基，按VEGF ELISA试剂盒操作要求测定。2、采用MTT法检测Apigenin对乳腺癌细胞增殖的影响接种于96孔板的MDA-MB-231细胞，经血清饥饿24h，用不同浓度Apigenin处理15h，按照MTT法的步骤对细胞增殖状态进行检测。3、应用RT-PCR法检测MDA-MB-231细胞中VEGF mRNA的表达水平经不同浓度Apigenin处理6h的细胞，采用Trizol试剂提取标本中的总RNA，在含溴化乙锭（EB）的1％琼脂糖凝胶上电泳检测RNA样品的完整性。用AMV一步法进行RT-PCR扩增。4、采用双荧光素酶系统检测MDA-MB-231细胞VEGF的转录活性接种到6孔板的MDA-MB-231细胞，用LipofectamineTM2000，pRL-TK（作内参）和pWAP11wt，或以pRL-TK（作内参）和pWAP11wt和pCEP4-HIF-1α共转染细胞12h。分别经血清饥饿24h，不同浓度Apigein处理15h，被动裂解液提取细胞总蛋白质。双荧光素酶报告分析试剂盒进行发光，荧光检测仪进行发光定量。通过转入pCEP4-HIF-1α来观察HIF-1α逆转Apigenin抑制MDA-MB-231细胞VEGF转录活性的作用。5、应用蛋白质印迹方法检测Apigenin对MDA-MB-231细胞中HIF-1α，p-AKT，p-ERK1／2，p53表达的时间依赖性和剂量依赖性效应不同处理的细胞，用裂解液抽提。含有等量蛋白的细胞裂解液用样品缓冲液溶解后，置于10％SDS-PAGE电泳分离，转移至硝酸纤维素膜，室温下封闭，过夜；分别加入特异的抗体，孵育2h，0.2mol／L NaOH洗膜去除膜上抗体，加碱性磷酸酶标记的二抗，孵育2h，用碱磷酶显色液显色，用凝胶成像仪成像。结果1、Apigenin抑制了人乳腺癌细胞VEGF分泌ELISA数据结果显示，用不同浓度Apigenin处理15h后，MDA-MB-231细胞培养基中的VEGF水平显著减少，而且这种抑制效应具有剂量依赖性。2、Apigenin抑制人乳腺癌细胞VEGF mRNA表达RT-PCR结果显示，在无血清状态下用Apigenin处理MDA-MB-231细胞6h，5μM Apigenin降低了VEGF mRNA表达水平，而随Apigenin浓度升高，VEGFmRNA表达水平降低更显著。3、MTT结果显示用Apigenin处理细胞15h，对MDA-MB-231细胞的增殖没有显著影响，这一结果提示Apigenin对人乳腺癌细胞VEGF蛋白分泌的抑制不是通过抑制细胞增殖实现的。4、通过分析Apigenin对VEGF启动子报告基因pMAP11wt的作用，结果显示Apigenin抑制了人乳腺癌细胞pMAP11wt的转录活性，并且随Apigenin剂量的增加，抑制作用更加显著。5、Apigenill抑制了人乳腺癌细胞HIF-1α蛋白的表达MDA-MB-231细胞中HIF-1α蛋白表达被Apigenin所抑制，并存在剂量和时间依赖性。Apigenin既抑制了HIF-1α基因的转录，又降低了HIF-1α蛋白的稳定性。6、Apigenin诱导了人乳腺癌细胞中p53蛋白的表达，抑制人乳腺癌细胞中AKT的磷酸化，对ERK1／2的磷酸化并没有明显影响。结论Apigenin可能通过降低VEGF启动子的转录活性，抑制VEGF mRNA的表达，降低分泌至胞外的VEGF蛋白水平而抑制人乳腺癌细胞VEGF的表达，并且这一作用与该细胞的增殖状态无关；Apigenin可能通过PI3K／AKT信号通路和诱导p53表达，降低HIF-1αmRNA的水平以及降低HIF-1α蛋白的稳定性而抑制HIF-1α的表达，进而下调了VEGF的表达。