糖尿病肾病的基本病变是肾小球细胞外基质(ECM)积聚，ECM的量是由合成和降解两个过程调节的，研究证明ECM降解减少也是导致ECM积聚的重要环节。肾脏内主要存在两类蛋白酶系统：纤溶系统与基质金属蛋白酶系统(MMPs)。纤溶系统主要包括纤溶酶原(plasminogen)、纤溶酶(plasmin)、纤溶酶原激活物(PA)与其抑制物(PAI)。纤溶系统不仅在维持血液凝血及纤溶平衡中起作用，而且参与细胞外基质的降解。PAI-1作为纤溶酶原激活物的主要抑制物，调节纤溶过程及纤溶酶介导的MMPs激活。研究表明，糖尿病大鼠肾皮质PAI-1活性明显升高，tPA活性下降，PAI-1mRNA表达显著增加。 糖基化终末产物(AGEs)在糖尿病肾病等慢性并发症的发病机制中起重要作用。正常大鼠给予外源性AGEs能造成肾小球肥大、系膜硬化、基质蛋白基因表达增加，引起类似人类糖尿病肾病的病变。我们以前的研究发现，AGEs可降低肾小球基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的活性和表达，至于AGEs对PA/PAI的影响尚无系统研究。 过氧化物酶体增殖体激活受体(PPAR)是一种新的治疗肾脏疾病的靶点。它是依赖配体的转录生长因子，是核激素受体超家族的成员。PPARs通过对转录水平的调控影响多种细胞过程，包括脂代谢、糖代谢平衡、细胞周期、细胞分化，炎症和细胞外基质重建等。在肾脏PPAR的三种形式均不同程度地表达，系膜细胞主要表达PPAR-γ。抗糖尿病药物四氢噻唑烷二酮类药物(TZDs)，如曲格列酮(troglitazone)，罗格列酮(rosiglitazone)是PPAR-γ的特异配体。在STZ诱导的糖尿病大鼠给予抗糖尿病剂量的曲格列酮(激活PPAR-γ)，在三个月内降低尿白蛋白排泄率，治疗的同时降低肾小球PAI-1表达，提示PPARr激活可直接改善糖尿病肾脏改变，其机制可能是通过抑制PAI-1的表达，减轻对纤溶酶及MMP-2的抑制，从而改善细胞外基质的降解。 本研究采用正常大鼠体内注射AGEs及体外肾系膜细胞培养。在体内实验中将大鼠分为5组：正常对照组，单纯血清组(正常大鼠血清100mg/kg)，AGEs组(AGEs100mg/kg)，氨基胍组(AGEs100mg/kg+AG40mg/kg)及罗格列酮组(AGEs100mg/kg+罗格列酮2mg/kg)。体外实验检测不同浓度、不同时间AGEs(糖化牛血清白蛋白)对系膜细胞的影响，以BSA(牛血清白蛋白)作为对照。检测技术包括有生化自动分析、RT-PCR、WesternBlot、形态学检测、免疫组织化学、ELISA和酶谱分析等。重点研究以下几个问题：(1)AGEs对大鼠肾脏PAI-1活性和表达的影响。(2)AGEs对大鼠系膜细胞PAI-1活性和表达的影响。(3)给予PPAR-γ激活剂能否缓解AGEs对PAI-1的影响。通过这些研究探讨AGEs、PPAR-γ的作用机制，为糖尿病肾病的防治提供理论依据。 研究主要结果如下： 一、AGEs对肾小球及系膜细胞结构和功能的影响 与单纯血清组比较，尿蛋白排泄率明显增高(P＜0.01)，肾小球PAS染色阳性物质沉着区明显增大，肾小球及小管FN和Ⅳ型胶原的含量增加，电镜下肾小球基膜呈不规则节段性增厚，足突明显融合，系膜区扩大。同时给予AGEs形成抑制剂氨基胍的大鼠上述形态改变明显减轻，血肌酐水平明显降低(P＜0.05)，尿蛋白排泄率也明显降低(P＜0.05)。 AGEs(0～200μg/ml)对系膜细胞增殖虽无明显作用，但能明显增加系膜细胞条件培养基中FN、Ⅳ胶原蛋白的含量。与相应浓度的BSA比较，12.5～200μg/mlAGEs可明显刺激系膜细胞FN的生成，100～200μg/mlAGEs能明显刺激系膜细胞Ⅳ胶原的生成。AGEs(100μg/ml)对系膜细胞条件培养基FN、Ⅳ胶原含量的影响均随着时间的增加有所提高。 二、AGEs对肾小球及系膜细胞PAI表达和活性的影响 与阴性对照组比较，AGEs组大鼠肾皮质PAI-1mRNA及蛋白表达均明显升高，而PA活性明显降低。给予氨基胍后这些改变明显减轻。与相应浓度的BSA组比较，AGEs组(0～200μg/ml)系膜细胞PAI-1蛋白含量明显增加；AGEs浓度为0～50μg/ml时PAI-1蛋白含量随AGEs浓度增加而增加，50～200μg/ml时到达平台期。AGEs(100μg/ml)能促进PAI-1mRNA表达明显增高(P＜0.01)。这些结果表明AGEs能促进PAI-1的表达，并且在一定浓度范围内(0～50μg/ml)为浓度依赖性。AGEs浓度为0～100μg/ml时，系膜细胞条件培养基中FN、Ⅳ胶原的含量与PAI的变化较为一致，AGEs浓度范围100～200μg/ml时，PAI含量不再增高而FN、Ⅳ胶原继续升高。提示AGEs引起的细胞外基质增加与PAI-1抑制降解有关，当PAI-1含量不再升高时，引起的FN、Ⅳ胶原含量增高可能有其他因素参与，如合成增加或降解酶活性降低。 三、AGEs对PPAR-γ表达的影响 本实验发现，在体外AGEs能促进系膜细胞PPAR-γmRNA表达，而在整体动物给予AGEs后未见肾皮质PPAR-γmRNA和蛋白质表达增加，免疫组化显示给予AGEs后虽然肾脏总体PPAR-γ蛋白阳性颗粒降低，但肾小球内未见PPAR-γ蛋白表达明显降低，这种结果可能由于肾皮质包含多种细胞成分，提示AGEs对肾内不同细胞的作用可能不同。 四、PPAR-γ激活剂的肾脏保护作用 与AGEs组比较，罗格列酮组大鼠尿蛋白排泄率明显降低(P＜0.05)，肾小球系膜细胞增殖较AGEs组减轻，系膜区PAS阳性物质减少，超微结构病变较AGEs组减轻，肾小球及小管FN和Ⅳ型胶原的含量也比AGEs组减少。此外，罗格列酮还表现出明显的降脂作用，而对正常血糖水平、BUN、血肌酐、尿肌酐及尿素氮无影响。与AGEs组比较，罗格列酮组PAI-1mRNA、蛋白质表达水平明显降低(P＜0.01)，uPA活性明显提高。在体外，罗格列酮可降低MC条件培养基中的FN含量，并且随着罗格列酮浓度的增加，PAI-1的含量呈降低趋势，但无统计学意义。 结论 本研究采用正常大鼠体内注射AGEs及体外系膜细胞培养，主要研究AGEs对大鼠肾脏PAI-1的影响以及给予PPAR-γ激活剂能否缓解AGEs对PAI-1的影响。得出以下结论： 1.AGEs能引起大鼠肾皮质PAI-1表达增高及PA活性明显降低。 2.AGEs能引起大鼠肾系膜细胞PAI-1表达增高，并与条件培养基中ECM含量呈正相关。 3.给予PPAR-γ激活剂罗格列酮能减轻AGEs引起的大鼠肾皮质PAI-1表达的增高及PA活性的降低。降低大鼠肾系膜细胞FN的产生。 本研究的主要创新点是，首次证明了AGEs能引起大鼠肾皮质PAI-1表达增高和PA活性明显降低，PPAR-γ激活剂罗格列酮能减轻AGEs引起的PAI-1及PA的变化。