论文部分内容阅读
miRNA (microRNA)是真核细胞重要的转录后调控因子,在细胞及生物的增殖凋亡、发育分化等过程中发挥重要作用,其功能异常可以导致多种病理状态,包括肿瘤的发生和转移。很多肿瘤中均发现了特异性的表达异常的miRNAs。目前认为,许多miRNAs在肿瘤发生过程中,或者作为抑癌基因下调原癌基因的活性,或者作为癌基因下调抑癌基因的活性,或者作为肿瘤转移调节因子发挥作用,其自身突变、缺失、易位及相互调控异常等还可导致相关基因异常表达,因此miRNA在人类肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用,并可作为肿瘤诊断的新型分子标记物。miRNA在肺组织的发育中起重要作用,其异常表达与肺癌的进展过程具有密切的关系,因此筛选、鉴定肺癌特异的miRNA并阐明其在肺癌发生发展过程中的分子机制对于肺癌的诊断、预后和靶向治疗有相当大的应用价值。我们在前期工作中,利用miRNA芯片分析9-顺维甲酸对肺癌细胞株A549miRNA表达谱的影响,发现9-顺维甲酸可上调miR-147a两倍以上,并经实时荧光定量PCR证实,由此推测miR-147a可能具有肿瘤抑制作用。据此,我们构建了miR-147a的表达载体pSilencer-147a,并对其在肺癌细胞A549中的表达和功能进行初步研究。目的：构建人miR-147a真核表达载体,检测其在肺腺癌细胞A549中的表达以及对A549细胞增殖能力、侵袭能力的影响。方法：1.重组质粒载体pSilencer-147a的构建：以A549细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增miR-147a的前体序列(pri-mir-147a),插入表达载体pSilencer-CMV neo,构建pSilencer-147a重组载体。2. qRT-PCR直接检测外源性miR-147a的表达：A549细胞接种到25ml培养瓶中,使用X-tremeGENE HP转染试剂,将pSilencer-147a转染A549细胞,pSilencer空载体作对照。48h后收集细胞提取RNA, qRT-PCR检测外源性]niR-147a的表达。3.重组质粒载体pMIR-147aT的构建：人工合成miR-147a的靶序列147aT,插入载体pMIR-REPORTTM Luciferase,构建pMIR-147aT重组质粒。4.报告基囚分析间接检测miR-147a的表达：将A549细胞接种到24孔板中,以pSilencer-147a和pMIR-147aT转染A549细胞,对照组分别为：①转染等量的pSilencer147a和pMIR-REPORT;②转染等量的pSilencer和pMIR-147aT;③转染等量的pSilencer和pMIR-REPORT。48h后收集细胞,裂解后检测它们的相对荧光素酶活性。5.MTT分析检测外源性miR-147a过表达对A549细胞增殖能力的影响：将A549细胞分别进行：①不做任何处理,②只用X-tremeGENE HP转染试剂处理,③以X-tremeGENE HP转染pSilencer质粒,④以X-tremeGENE HP转染pSilencer-147a质粒。然后将处理后的细胞接和,到96孔板中继续培养24～96h,MTT法检测其转然后对细胞增殖能力的影响。6. Matrigel侵袭实验检测外源性miR-147a过表达对A549细胞侵袭能力的影响：A549细胞转染后,用无血清培养基将细胞接种到Transwell小室中,继续培养48h后,擦去未穿过的细胞,甲醇固定小室底部已穿过的细胞并以吉姆萨染液染色,计算侵袭效率7. pGL4-AP1等重组质粒载体的构建：人工合成肿瘤信号应答元件API, ELK1, cMYC, STAT3, FOXO, TCF,插入载体pGL4.23[luc2/minP] Vector中,构建肿瘤信号应答元件.荧光素酶报告基因重组载体pGL4-AP1, pGL4-ELK1, pGL4-cMYC, pGL4-STAT3, pGL4-FOXO, pGL4-TCF。8.报告基因分析检测miR-147a对肺癌相关肿瘤信号途径的影响：转染前一天,A549细胞接种于48孔板,以X-tremeGENE HP分别将pGL4-AP1,pGL4-ELK1, PGL4-cMYC, pGL4-STAT3, pGL4-FOXO, pGL4-TCF重组载体与pSilencer-147a进行共转染,同时进行pSilencer空载体和pGL4-AP1, pGL4-ELK1, pGL4-cMYC, pGL4-STAT3, pGL4-FOXO, pGL4-TCF的共转染作为对照。转染48h后收集细胞,检测其相对荧光素酶活性。结果：1.构建的pSilencer-147a重组质粒,经限制性酶切和DNA测序证实构建成功。2.pSilencer-147a转染A549细胞后,qRT-PCR检测到明显的外源性miR-147a表达。3.构建的pMIR-147aT重组质粒,经限制性酶切和DNA测序证实构建成功.4.报告基因分析结果证实,pSilencer-147a可在A549细胞中有效表达功能性的miR-147a.5.MTT结果显示,miR-147a过表达可明显抑制A549细胞的增殖,转染48h,72h,和96h后,与对照组相比抑制效果分别达到13%,18%和30%。6.Matrigel侵袭实验结果显示,miR-147a过表达可明显抑制A549细胞的侵袭能力,转染48h后,与pSilencer4.1阴性对照组细胞相比,实验组侵袭至Transwell小室底膜下表面的细胞数减少了72%。7.构建的pGL4-AP1,pGL4-ELK1,pGL4-cMYC,pGL4-STAT3,pGL4-FOXO, pGL4-TCF重组质粒,经限制性酶切和DNA测序证实构建成功。8.报告基因分析结果显示miR-147a过表达可显著下调pGL4-AP1(下调了50%)、pGL4-ELK1(下调了57%)、pGL4-cMYC(下调了58%)的荧光素酶活性。结论：成功构建了人miR-147a真核表达载体,并在肺腺癌细胞A549中有效表达,对A549细胞的增殖和侵袭产生抑制作用,该作用可能与miR-147a对EGFR-RAS-MAPK信号途径的抑制有关。