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呼吸道疾病是严重影响当前养猪业发展的一种主要疾病,猪链球菌（Streptococcus suis,SS）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）和猪源支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）是养猪业中常见的三种重要的呼吸道常在菌和致病菌。猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌在临床上常发生混合感染,三者混合感染所引起的猪呼吸道综合征（PRDC）在临床中普遍存在,多病原的混合感染在加强病原对机体损害作用的同时,也提高了PRDC的发病率和死亡率。这三种病原菌均有多个血清型且具有相似的临床症状和感染途径,主要侵害幼龄仔猪和保育猪,能引起较高的病死率,临床上鉴别难度较大。多重PCR技术和实时荧光定量PCR技术分别凭借其高通量低成本、特异灵敏、精准定量等优势,现已在病原检测和临床诊断中被广泛应用。在本研究中,我们建立了简便快捷和灵敏低成本检测猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的多重PCR检测方法以及能直接特异性检测和准确定量猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的TaqMan多重荧光定量PCR检测方法,为相关疾病的流行病学调查、疾病防控、细菌致病机制的研究以及诊断试剂盒的研制提供一种新兴的技术手段。1.猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌普通多重PCR检测方法的建立为建立同时鉴别检测猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的方法,本研究针对猪链球菌gdh基因、副猪嗜血杆菌16S r RNA基因和猪源支气管败血波氏杆菌fla基因设计了3对特异性引物。分别提取猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的全基因组DNA作为PCR扩增模板。通过建立和优化多重PCR检测方法反应条件和体系;评估该方法的特异性、敏感性、重复性,最终成功建立了同时鉴别检测3种猪呼吸道常见病原菌的多重PCR检测方法。试验结果显示,猪链球菌最佳引物浓度为0.35μmol/L,副猪嗜血杆菌最佳引物浓度为0.25μmol/L,猪源支气管败血波氏杆菌最佳引物浓度为0.3μmol/Lμmol/L,最佳退火温度为57℃时扩增效果最佳;该检测方法仅特异性扩增猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌,与其他主要病原菌无交叉反应,特异性较强;对猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的检测下限均为10~2ng/μL,敏感性较高;多次重复多重PCR试验结果完全相同,重复性良好。2.猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立为建立同时鉴别检测猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的方法,本研究针对猪链球菌gdh基因、副猪嗜血杆菌16S r RNA基因和猪源支气管败血波氏杆菌fla基因设计了3对特异性引物和3条TaqMan荧光探针。分别从猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的基因组DNA中扩增出gdh、16S r RNA和fla基因,然后经过回收、纯化PCR产物,将其分别连接至p MD19-T载体后,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂板进行培养,筛选阳性克隆并增菌培养,然后提取重组质粒进行PCR及测序鉴定,最终获得绘制标准曲线的重组质粒标准品。通过建立和优化TaqMan多重荧光定量PCR检测方法反应条件和体系;使用重组质粒标准品绘制标准曲线;评估该方法的特异性、敏感性、重复性,最终成功建立了同时鉴别检测3种猪呼吸道常见病原菌的TaqMan多重荧光定量PCR检测方法。试验结果显示,猪链球菌和副猪嗜血杆菌引物浓度均为0.3μmol/L,猪源支气管败血波氏杆菌引物浓度为0.25μmol/L,探针浓度均为0.15μmol/L,退火温度为57℃,循环数为40时扩增效果最佳;标准曲线呈现良好的线性关系;该检测方法仅特异性扩增猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌,与其他主要病原菌无交叉反应,特异性强;对猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌重组质粒标准品的检测下限值分别为8.205×10~1拷贝/μL、9.847×10~1拷贝/μL和7.064×10~1拷贝/μL,敏感于常规PCR 100倍,具有较高敏感性;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2.5%,具有良好的重复性。3.猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌普通多重PCR和TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的应用将本研究建立的猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌普通多重PCR和TaqMan多重荧光定量PCR检测方法应用于临床样品的检测,检验本方法在临床诊断中的可行性并比较两种方法的优劣。首先,对采集的96份疑似病料进行常规的细菌分离鉴定,用本研究所建立的多重PCR和TaqMan多重荧光定量PCR检测方法分别进行检查,结果表明,细菌分离鉴定检测样品阳性率为30.21%（29/96）,多重PCR方法检测样品阳性率32.29%（31/96）,TaqMan多重荧光定量PCR检测样品阳性率37.5%（36/96）;该多重PCR方法与细菌分离鉴定检测之间的符合率为97.92%,TaqMan多重荧光定量PCR方法与细菌分离鉴定之间的符合率为92.71%,两种方法比常规细菌分离鉴定方法更为准确;TaqMan多重荧光定量PCR方法与多重PCR方法之间的符合率为94.79%。多重PCR方法的检出率高于细菌分离鉴定检测,操作简便,可在4 h内检测出结果;而TaqMan多重荧光定量PCR方法对猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的检出率明显高于多重PCR方法和细菌分离鉴定检测,特异性和敏感性高,更为快速高效,可在2 h内检测出结果。证明本研究建立的多重PCR方法比细菌分离鉴定检测方法更为敏感且大大缩短了检测时间,TaqMan多重荧光定量PCR方法较于多重PCR方法具有更高的感敏性和更高效的检测效率。因此,猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌多重PCR方法和TaqMan多重荧光定量PCR方法在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和极高的实用价值。