在长期的进化过程中,植物形成了一套完整的机制,用于调节自身的生长发育以适应或抵御外界生物和非生物胁迫,在这些进程中转录因子(WRKY、DREB、NAC、MYB等)发挥了重要的调控作用。WRKY转录因子家族是近十几年来发现的一类植物特有的转录因子,它们在植物体内是非组成型表达的,受生物及非生物胁迫(水杨酸、病原诱导子、高盐、干旱、低温等)诱导,主要参与生物与非生物胁迫应答和植物衰老,有关对植物发育的调控研究报道很少,仅见参与调控了种子和表皮毛的发育。迄今为止,尚未见它们参与调控植物开花和分枝发育的报道。植物开花是植物从营养生长到生殖生长转折的关键,具有很强的可塑性。在各种外界环境和内部因子的影响下,植物会选择在适当的时机开花进而获得生殖的成功。植物开花是一个涉及多因子相互作用的复杂系统。目前,在拟南芥中主要存在4条调控植物开花的途径：光周期途径,春化途径,自主途径和赤霉素途径。研究表明,其它一些因子也参与了开花调控,比如蔗糖和非生物胁迫因子。一些外界胁迫因子(干旱、紫外线和病原菌)能够促进植物开花,这是植物逃避逆境的一种适应机制。通常情况下,高盐胁迫会抑制拟南芥开花,其调控机制已有-些研究。但尚未见有关高盐胁迫促进植物开花的报道。植物的分枝是从茎顶端分生组织衍生出的腋生分生组织中分化出来的,包含两个关键的发育过程：腋生分生组织在叶腋部位的形成和腋生分生组织的生长发育(腋/侧芽的生长)。它决定着植物地上部分的株型,与作物的产量密切相关。植物的分枝发育受到各种外界环境条件、遗传因素和植物激素的影响。目前,多个调控植物分枝发育的基因已被发掘。迄今,有关WRKY转录因子调控植物分枝发育的研究尚未见报道。本研究从拟南芥激活标签突变体库中筛选得到了一株较Co1-0开花早、花器官大、植株矮小、分枝多的突变体D27。Tail-PCR和RT-PCR分析推测,该表型可能由WRKY转录因子基因WRKY71的过表达引起。遗传分析发现,该突变体的表型稳定。在此基础上,利用Col-0、D27 (WRKY71-1D)及其敲除系wrky71-1研究了WRKY71在正常条件和高盐胁迫下对拟南芥开花的作用,揭示了WRKY71介导高盐诱导拟南芥开花提前的分子机制,分析了WRKY71对拟南芥分枝发育的贡献及其可能机制,为进一步阐明拟南芥开花和分枝发育的分子调控机制奠定了基础。主要研究过程及实验结果包括：1.WRKY71转录因子的分离鉴定及其功能初探1.1突变体的筛选和基因分离鉴定从拟南芥激活标签突变体库中,筛选得到了一株突变体D27,与野生型Col-0相比,该突变体植株矮小、开花早、花器官增大、分枝多。Tail-PCR和RT-PCR分析推测,该突变体的表型可能是由WRKY71的过表达引起。购买并筛选获得了wrky71-1敲除系。1.2 WRKY71的表达模式时空表达模式：Real time-PCR分析发现,WRKY71在拟南芥Col-0生长的前三周内表达逐步上调,随后逐步下降；其在各个组织器官中均有表达,其中在角果中表达量最高。进一步的GUS染色分析发现,WRKY71亦在各组织器官中表达,在根、表皮毛及托叶中表达显著。亚细胞定位发现,WRKY71定位于洋葱表皮细胞和拟南芥原生质体的细胞核中。转录激活活性实验证实了该基因具有转录激活活性。对非生物胁迫和激素的应答模式：Real time-PCR分析发现,WKRY71受高盐和ABA的诱导而高表达,其由ABA依赖的途径受高盐诱导。1.3 WRKY71介导盐胁迫下拟南芥的早开花以200mM NaCl处理在土壤中生长的Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1植株(7天和10天各浇灌1L 200mM NaCl),发现WRKY71-1D在第23天开花,仅比正常条件下延迟1天,而Col-0和wrky71-1在第35天开花,比正常条件下延迟1周,说明WRKY71-1D的开花进程对高盐不敏感。2. WRKY71调控拟南芥花发育的分子机制研究2.1 WRKY71促进拟南芥开花的确定WRKY71过表达植株35S：：WRKY71的表型与WRKY71-1D一致,佐证了WRKY71-1D的表型是由WRKY71过表达引起的。2.2 WRKY71在花序分生组织、花原基及花器官原基中表达RNA原位杂交发现WRKY71在15天的花序分生组织和花原基中表达,在17天的花序分生组织和花器官原基中表达。表明WRKY71可能参与了顶端花序分生组织的形成以及花的发育。2.3 WRKY71促进开花转折组织学纵向切片观察发现花原基出现(开花转折)的时间分别为：100%的WRKY71-1D在第11天、90.4±5.7%的Col-0在第15天、而仅有37.6±3.3%的wrky71-1在第15天。扫描电镜结果同该结果一致,表明WRKY71具有促进拟南芥开花转折的作用。2.4高盐胁迫下WRKY71亦促进开花转折组织学纵向切片分析发现高盐胁迫下花原基出现的时间分别为：100%的WRKY71-1D在第12天,32.7±3.3%的Col-0在第17天,而仅有21.6±2.9%的wrky71-1在17天,表明WRKY71-1D的开花起始几乎不受到高盐的抑制。可见,WRKY71在高盐胁迫下亦促进开花转折。综上所述,WRKY71受高盐的诱导,WRKY71的过表达促进拟南芥的开花,因此,推断WRKY71介导了高盐诱导拟南芥开花提前。2.5 WRKY71不参与四条主要开花途径Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1均能正常应答日照长度(长日照和短日照)、低温和GA信号,在处理条件下,WRKY71-1D的开花时间依然早于Col-0和wrky71-1。四条途径中的一些相关基因在三系中表达水平相近,而WRKY71在一些开花突变体(gi-2、co、ft、fve-4、Id-1、fld-1、fca-9)中的表达变化亦不明显,表明WRKY71可能不参与上述4条途径。2.6 WRKY71通过影响蔗糖运输而促进拟南芥开花RT-PCR分析发现蔗糖合成代谢和信号转导的相关基因在三系中的表达差异不明显,表明WRKY71可能不影响拟南芥蔗糖的合成代谢和信号转导。蔗糖转运子基因SUC8和SUC9在WRKY71-1D中表达下调,EMSA实验证明WRKY71与SUC8和SUC9启动子区的W-box结合,表明WRKY71通过直接抑制SUC8和SUC9的表达,促进胞外蔗糖运输到茎顶端以促进拟南芥的开花。2.7 WRKY71促进花分生组织决定基因表达Real time-PCR分析发现在非盐胁迫和盐胁迫条件下,花分生组织决定基因LFY、API、CAL和FUL在WRKY71-1D中均上调表达。这与WRKY71-1D在非盐胁迫和盐胁迫条件下开花早的表型一致。2.8 WRKY71结合LFY启动子的W-boxEMSA实验证明WRKY71能强烈地结合在LFY启动子的W-box上,微弱地结合在CAL启动子的W-box上,不能与AP1启动子的W-box结合；ChIP实验亦证明了WRKY71能结合在LFY启动子的W-box上,而不能与CAL结合,表明WRKY71通过直接上调LFY表达而促进拟南芥开花。2.9杂交互补验证对(?)WRKY71-1D×LFY::GUS杂交种和LFY::GUS进行GUS染色分析发现,前者的GUS活性高于后者,表明WRKY71可提高LFY的翻译水平。WRKY71-1D×lfy植株与WRKY71-1D表型相似,但是不能开花结实,表明LFY的缺失阻断了WRKY71-1D的开花,从而证实了WRKY71是通过调控上调LFY表达来促进拟南芥的开花。2.10 WRKY71促进拟南芥花器官的发育WRKY71-1D的萼片、花瓣、雄蕊和心皮均比Col-0和wrky71-1的大,其花器官发育快速。Real time-PCR分析发现,花器官发育相关基因AP1、AP3和AG,花器官大小的基因UFO和干细胞维持和分化相关基因WUS和CLV3在WRKY71-1D中表达上调。ChIP和EMSA实验证明WRKY71仅能与AP3启动子的W-box结合,而不能与UFO和WUS结合,表明WRKY71通过直接或间接地上调上述基因引起花器官发育提前和花器官增大。总之,拟南芥WRKY71通过直接上调LFY,间接上调AP1、CAL和FUL来促进开花起始；通过直接上调AP3,间接上调AP1和AG而促进花器官发育；间接上调UFO而促进花器官增大；间接上调WUS和CLV3而提高顶端分生组织活性而加快茎顶端分生组织干细胞的增殖和分化。3.WRKY71调控拟南芥分枝发育的功能研究3.1 WRKY71-1D突变体分枝数目增多对长日照下生长7周的Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1进行了株高、角果数、分枝数目和附着枝数目统计,发现：三者的平均株高分别为34.2±3.4、9.1±0.6、34.7±2.8cm；平均结荚率分别为128.7±30.2、62.5±18.8、129.6±32.2个；分枝总数分别为55.1±6.1、27.3±2.3、25.3±3.6个；附着枝数分别为22.6±5.3、1.1±0.8、1.2±0.4个。3.2 WRKY71-1D的腋芽不休眠组织学纵向切片分析发现,WRKY71-1D植株腋芽出现在13天,15天时已膨大,而Col-0和wrky71-1在15天还未见腋芽发生。扫描电镜观察发现,WRKY71-1D莲座叶腋芽在21天已见花原基,而Col-0仅分化出叶子,wrky71-1仅见叶原基。生长至32天时,WRKY71-1D腋芽生长发育成侧枝,而Col-0和wrky71-1侧芽仍处于休眠状态,表明WRKY71参与调控了拟南芥侧枝的形成和发育过程。3.3 WRKY71在叶腋处表达通过RNA原位杂交分析发现,WRKY71在Col-0的叶腋处表达,进一步表明WRKY71参与了拟南芥侧枝的形成进程。3.4 WRKY71促进分枝基因的表达调控分枝发育相关基因的表达分析发现,WRKY71-1D中RAX2表达明显的上调,LAS表达微弱的上调。EMSA实验证明,WRKY71与RAX2启动子的W-box结合,表明WRKY71通过直接上调RAX2而引起拟南芥的多分枝。3.5 WRKY71-1D维管束发育缺陷对Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1茎的横切面结构的观察发现,WRKY71-1D茎很细,仅有6个维管束,比Col-0少两个；其束间形成层细胞层数比Col-0多1-2层,表明WRKY71-1D的茎维管束系统发育有缺陷。已知拟南芥维管束发育与生长素的功能密切相关,尤其是生长素运输能力对维管束发育影响大,因此,推测WRKY71可能参与了生长素运输的调控。3.6 WRKY71促进生长素的运输离体节点实验分别将带有腋芽的Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1茎段上端插入含有1μM 2,4-D的1/2MS培养基中,下端插入不含2,4-D的1/2MS培养基中,腋芽朝上培养7天,发现Col-0和wrky71-1腋芽有一定程度的伸长生长,而WRKY71-1D腋芽未见生长,推测在WRKY71-1D中侧芽生长的抑制可能与其生长素运输能力的增强有关。生长素运输基因表达生长素运输相关基因的表达分析发现,PIN1在WRKY71-1D中上调表达,表明WRKY71可能通过提高生长素运输能力对分枝发育起作用。3.7 WRKY71不影响生长素的生物合成分析生长素合成相关基因表达水平发现,NIT4和CYP79B3在WRKY71-1D中下调表达。但HPLC分析发现,Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1中自由IAA含量相近,表明WRKY71不影响拟南芥体内生长素的合成。3.8 WRKY71不影响生长素的信号转导将生长4天的Col-0、WRKY71-1D和wrky71-1转入含10nM和1μM的IAA的1/2MS培养基上生长至14天,发现三系的主根、侧根数目及其长度变化不大,表明WRKY71-1D能正常的响应生长素信号。RT-PCR分析发现,生长素信号转导相关基因在三系中表达差异不明显,表明WRKY71可能不参与生长素的信号转导。结论,WRKY71通过直接上调RAX2引起了拟南芥分枝增多,通过提高生长素的运输能力对分枝发育起作用。