多发性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一种T细胞介导，以中枢神经系统(centralnervous system，CNS)局灶性髓鞘脱失为主要病理改变的慢性自身免疫性疾病。该病的病变位于脑部或脊髓，神经病理主要表现为局灶性脱髓鞘、少突胶质细胞死亡、轴突变性以及星型胶质细胞的增生，目前MS的发病机制尚未明确。在我国，随着人们的生活习惯和生态环境改变，以及对MS的认识和诊断水平的提高，MS已成为临床常见的神经系统疾病之一。目前MS的治疗主要依赖药物，包括糖皮质激素、β干扰素和乙酰格雷替酮等，但这些药物只对部分MS病人有效，仍有相当部分患者饱受无药可治的痛苦，成为急待解决的问题。因此，通过建立MS的动物模型来探讨MS的发病机制及临床治疗是目前迫切的医学研究工作。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是人为地用免疫原免疫易感动物产生的一种CD4+辅助性T细胞介导的自身免疫性、炎性、脱髓鞘性、脑脊髓炎，是研究自身免疫性疾病常用的动物模型。EAE具有与多发性硬化相似的临床和病理特点，被公认为MS的理想模型，慢性复发性EAE (Chronicrelapsing EAE, Cr-EAE)，与“复发-缓解型”MS相似。因此，通过EAE的实验研究对于探讨MS的病理特点、发病机制和治疗效果颇有价值。FTY-720：是近几年新开发的一种免疫抑制剂，该药选择性减少外周血液循环中的T淋巴细胞数量，作用机制独特，免疫抑制效果强大，毒副作用小。口服FTY-720在实验动物器官移植中具有免疫抑制活性，关于FTY-720诱导免疫耐受的研究目前还不多。2012年最新文献报道了FTY-720在移植中的分子作用机制，基于此理论基础，我们探讨FTY-720对EAE的治疗作用及其机制。本实验拟构建MS的动物模型EAE小鼠，在此平台开展“药物干预实验、作用机制探讨”二大部分的实验研究，分别探讨FTY-720对EAE的免疫抑制作用及FTY-720对EAE的作用机制。希望通过对EAE的实验研究，进一步认识中枢神经脱髓鞘疾病的免疫发病机制及病理改变特点，为MS的基础研究与临床治疗探索新的途径。目的第一部分：FTY-720对EAE的免疫作用本实验通过构建EAE小鼠模型，探讨EAE的典型临床与病理特点；通过观察EAE发病早期应用免疫抑制剂FTY-720治疗后其病程变化及病理特点，探讨免疫抑制治疗对EAE发病的干预作用。第二部分：FTY-720对EAE的作用机制本实验拟开展体外细胞培养实验观察FTY-720对CD4+T淋巴细胞增殖与凋亡的影响、体内干预实验观察FTY-720对CD4+T淋巴细胞的抑制作用、检测EAE小鼠脊髓组织细胞因子及胞内信号分子的表达来筛选FTY-720影响炎症因子表达的信号通路及信号蛋白，探讨FTY-720的作用机制。方法第一部分：药物干预实验本实验采用“前瞻性队列研究”设计方案，经MOG35-55主动诱导C57BL/6小鼠构建慢性单相型EAE模型，分为病例组与三个干预组，病例组喂食生理盐水治疗，干预组喂食不同剂量免疫抑制剂FTY-720，分别观察病程中四组小鼠的体重、临床评分、发病率等临床指标特点，并于实验终点时间观察EAE小鼠脊髓的病理特点，四组间数据进行比较分析。第二部分：生化检测实验本实验采用“流式细胞仪”检测EAE小鼠体外培养的CD4+T淋巴细胞增殖与凋亡程度，评估FTY-720对EAE小鼠体外CD4+T淋巴细胞是否有免疫抑制作用；采用“流式细胞仪”检测EAE小鼠经FTY-720治疗后脾脏血CD4+T淋巴细胞数量变化，评估FTY-720对EAE小鼠体内CD4+T淋巴细胞的免疫抑制效果；采用“Rt-PCR”检测EAE小鼠脊髓组织炎症因子表达，评估FTY-720对炎症因子表达变化的影响；采用“Westernblot”检测实验小鼠脊髓组织细胞胞内信号蛋白的表达，筛选FTY-720影响炎症因子表达的信号通路及信号蛋白。结果第一部分：FTY-720对EAE的免疫作用1、病例组EAE小鼠：临床神经功能评分、体重及发病率等呈现慢性单相表现，存在“发病-非缓解”现象，具备典型MS发病过程；其病理观察也表现典型炎性细胞浸润、髓鞘脱失等病理特点。2、干预组EAE小鼠：临床神经功能评分、体重及发病率等呈单相表现，其病理观察虽有炎性细胞浸润、髓鞘脱失等特点，但与病例组比较，临床症状及病理特点均不典型。第二部分：FTY-720对EAE的作用机制1、体外细胞培养实验显示：FTY-720干预后，实验小鼠CD4+T淋巴细胞增殖减少、凋亡增加，提示FTY-720可抑制CD4+T淋巴细胞的增殖、促进其凋亡。2、体内药物干预实验显示：FTY-720干预后，实验小鼠脾脏血CD4+T淋巴细胞数量减少，提示FTY-720可减少外周血CD4+T淋巴细胞的激活。3、细胞因子表达检测显示：提示FTY-720可抑制CD4+T淋巴细胞分泌IL-10、IL-17等特异性炎症因子，并可抑制IL-2、IL-6、TNF-α、iNOS、INF-γ等非特异性炎症因子的分泌，但对IL-4细胞因子的表达无明显影响。4、信号分子表达检测显示：经FTY-720干预后，EAE小鼠脊髓cPLA2的表达下降。结论第一部分：FTY-720对EAE的免疫抑制作用1、临床评估：用MOG35-55诱导C57BL/6小鼠，可成功构建“慢性单相”EAE模型。2、干预评估：早期应用免疫抑制剂FTY-720，可减轻EAE临床神经功能评分、可减少EAE的发生、改变EAE的病程。3、药量评估：FTY-7200.3mg/kg/d可有效减少EAE的发生。第二部分：FTY-720对EAE的免疫作用机制1、抑制EAE小鼠外周血CD4+T淋巴细胞的激活，减少外周血CD4+T淋巴细胞数量；2、抑制EAE小鼠CNS特异性及非特异性炎症因子的分泌，下调炎性反应；3、可能通过下调信号分子cPLA2的表达来抑制炎症因子分泌，cPLA2信号途径参与了免疫抑制反应。