论文部分内容阅读
热应激是指动物在受到超过机体本身体温调节能力的过高温度刺激时,引起机体的非特异性防御反应和特异性障碍在内的全身性适应症。为了科学研究动物热应激机制,许多研究者通过建立试验动物热应激模型,如鸡、猪、大鼠和小鼠等,观察检测模型动物的血液生化指标,激素水平,细胞因子(如IL-2、IL-6、TNF等)水平和组织器官病理变化等。研究还发现热应激条件下,动物热休克蛋白水平也发生相应的变化,如HSP70、HSP60和HSP90等,并认为机体的热休克蛋白水平是动物抗热应激指标之一。本研究以富硒女贞子缓解奶牛热应激为目标,在建立小鼠热应激模型的基础上,以富硒女贞子滋阴补肾,保护肝脏,免疫调节等功能为切入点,通过统计热应激小鼠死亡率,检测生长指标、血液生化,激素水平,免疫器官指数及血清IL-2水平,并利用实时荧光相对定量法检测肝脏HSP70mRNA表达的相关热应激指标,来探索评价富硒女贞子的抗热应激作用,并初步探讨其抗热应激机制。试验一富硒女贞子对小鼠急性热应激的预防作用研究富硒女贞子对急性热应激小鼠存活率的影响,将126只ICR小鼠随机分成：常温对照组(C)、热应激组(HS)、普通女贞子组(CLL)、富硒女贞子高剂量组(HSLL)、富硒女贞子中剂量组(MSLL)、富硒女贞子低剂量组(LSLL);除了C组,其他组均置于温度(T)43±1℃,湿度(RH)50-60%的环境中急性热应激2h,观察小鼠临床状态,统计小鼠死亡率并进行肝组织切片病理观察。结果显示：富硒女贞子各组小鼠的死亡率均明显降低,其中0.75g/kg剂量的富硒女贞子组死亡率为38.1%,极显著低于最低HS组的79.2%(P<0.01),且显著低于CLL的61.9%(P<0.05)；病理观察发现,LSLL组小鼠肝细胞水肿和颗粒变性等损伤明显减轻。提示0.75g/kg剂量富硒女贞子对急性热应激小鼠的预防作用最佳。试验二富硒女贞子对热应激小鼠生长性能、血清生化及其肝组织变化的影响为观察富硒女贞子对小鼠的抗热应激作用及其生长性能、血清生化及其肝组织变化的影响,将108只小鼠随机分成常温对照组(C)、热应激组(HS)、普通女贞子组(CLL)、富硒女贞子高剂量组(HSLL)、富硒女贞子中剂量组(MSLL)、富硒女贞子低剂量组(LSLL);除C组外,其他各组于T为40±1℃,RH为40-50%人工气候室中,11：00-13：00热应激2h,应激期间不间断供水；其余时间置于白天T为35±4℃,RH为45-50%环境下,夜晚T为28±5℃,RH为30-40%环境下,连续应激7天。结果发现：在高温应激条件下,热应激各组的增重率(WG)和生长率(SGR)均较C组有不同程度的降低,热应激处理组之间,LSLL组的WG和SGR分别显著和极显著高于HS组(P<0.05、P<0.01)；各处理组血清ALT和AST性均呈上升趋势,其中女贞子组(CLL)和富硒女贞子组(HSLL、MSLL、LSLL)血清ALT和AST活性较HS组有不同程度的降低。血清蛋白在热应激3d,LSLL组TP、ALB和GLO均高于HS、CLL、HSLL和MSLL组,在热应激7d,LSLL组明显高于CLL组,表明0.75g/kg富硒女贞子组比1.5g/kg普通女贞子组具有更好的提高血清蛋白的作用。试验结果提示,富硒女贞子和女贞子对热应激造成小鼠生长不良及肝脏损伤均具有明显的缓解作用。尤以0.75g/kg剂量富硒女贞子在热应激过程中能更好地降低血清ALT和AST,提高血清TP、ALB和GLO的浓度,从而提高小鼠的抗热应激能力。试验三富硒女贞子对热应激小鼠免疫器官指数、血清IL-2和激素动态水平的影响为研究富硒女贞子对热应激小鼠免疫调节的作用,在上述热应激动物模型试验,通过剖检观察了热应激小鼠免疫器官指数,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞因子IL-2和ACTH、CORT、T4、T3等激素在热应激期间的动态变化水平。结果发现：CLL组、MSLL组、LSLL组免疫器官指数均显著高于HS组(P<0.05)：热应激前期(1-3d),HS组血清中ACTH浓度显著增高(P<0.01),CLL、HSLL、MSLL组均没有显著差异；HS组的CORT浓度较C组显著升高(P<0.05),女贞子各组均有降低,其中MSLL组与C组没有显著差异(P>0.05)；HS组血清中的T3、T4浓度总体上呈现下降的趋势,但是CLL、LSLL组的T3、T4浓度均显著高于HS组(P<0.01)；IL-2方面,在热应激前期(1-3d),富硒女贞子HSLL组、LSLL组的IL-2显著高于HS组和C组(P<0.05、P<0.01)。结果表明：富硒女贞子能够增强热应激小鼠免疫调节功能,并通过机体的内分泌-免疫调节网络系统,改善机体的内环境稳态,发挥提高动物耐热能力的作用,且以低剂量(0.75g/kg)富硒女贞子组作用最佳。试验四富硒女贞子对热应激小鼠肝脏HSP70及其mRNA表达的影响试验分别采用ELISA法和荧光相对定量PCR法检测小鼠肝脏热应激休克蛋白(HSP70)及其mRNA的表达量,观察其在热应激期间的动态水平,以探讨富硒女贞子抗热应激的作用机制。结果表明：在热应激期间,处理组HSP70的表达量呈上升趋势,且热应激初期(1-3d)富硒女贞子各组均显著高于HS组(P<0.05),热应激7d,女贞子组和HS组HSP70显著高于C组(P<0.05),而富硒女贞子各组与C组无显著差异(P>0.05)。热应激各组小鼠肝脏中HSP70mRNA表达均呈先降后升,总体上升的趋势,且在热应激7d,CLL、MSLL、LSLL组HSP70mRNA表达量均显著低于HS组(P<0.05)。结果表明：富硒女贞子和女贞子都具有明显促进热应激早期小鼠肝组织中HSP70mRNA的表达和HSP70的合成,从而使应激小鼠机体更快速地适应应激性环境,减少应激损伤性肝脏病理性蛋白的合成,其综合作用效果尤以0.75g/kg富硒女贞组最佳。结论：富硒女贞子能有效降低急性热应激小鼠的死亡率,对小鼠热应激具有显著的防治作用,尤以0.75g/kg体重剂量的富硒女贞作用最佳。既能减少热应激造成的小鼠生长抑制,提高其血清总蛋白、白蛋白和球蛋白的含量,又能提高免疫。其作用机理：与提高血清T4、T3水平,调节ACTH的热应激性过度升高,调控内分泌-免疫网络和促进热应激早期小鼠肝组织中HSP70mRNA的表达和HSP70的合成,减少肝损伤等应激病变,维持机体内环境稳态有关。