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实验背景:脊髓损伤,主要以颈部、胸部及腰部的脊髓损伤为主,多为高能量损伤,高处坠落、车外伤、暴力击打等是常见原因[1]。脊髓损伤是脊柱损伤最为常见也是最为严重的并发症,常常导致损伤节段以下的肢体出现不完全性或者完全性的感觉及运动功能的障碍,具有高致残率和高死亡率[2-4],不仅危害患者的身体及心理健康,也给其家庭带来巨大的经济负担和社会压力。近年来,随着经济水平的高速发展,脊髓损伤的发病率也逐年升高。对于脊髓损伤的救治的需求也是进一步加大。科技的发展,使得人类对于疾病的研究从细胞水平发展到了分子水平,再到基因水平。2000年,人类基因组工程宣布完成,细胞移植和基因治疗,作为热门的研究焦点和方向,已经成为了解决脊髓损伤发展最为迅猛的学科。但到目前为止,国内外对脊髓损伤的药物和外科手术治疗均未取得满意的临床疗效[5-8]。世界各国科研和医务工作者均把脊髓损伤作为一项难题,对其研究投入了巨大的人力、财力和物力。骨髓间充质干细胞最早于1968年由Friedenstein等证实了其存在[9],之后的1976年,Friedenstein在体外应用细胞分离培养技术,成功的检测到了成纤维细胞前体细胞[10]。之后关于各种干细胞的研究如雨后春笋般,陆续火热的开展起来,如胚胎干细胞,包括ES细胞和EG细胞;成体干细胞,包括脂肪干细胞、血液干细胞、表皮干细胞等[11-14]。骨髓原始的间充质干细胞是骨髓的基质干细胞,是在哺乳动物的骨髓基质中的具有可分化形成骨组织、软骨组织、脂肪组织、神经组织和肌肉组织的多种分化潜能的细胞亚群,并且具有分泌白细胞介素-6（IL-6）[15]、白细胞介素-11（IL-11）[16-18]、白细胞抑制因子（LIF）[19-21]、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）[22-24]和干细胞因子（SCF）[25-27]等多种生长因子的功能。骨髓间充质干细胞可以在脊髓损伤的局部转化形成神经元细胞,并促进其结构的成熟和功能的修复。另外,骨髓间充质干细胞能够分泌多种细胞因子,其中包括:血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、干细胞衍生因子（SDF）等[28-32],这些细胞因子能够促进细胞增殖和细胞生长,强化细胞的形态分化及促进功能恢复。在细胞移植治疗脊髓损伤中得到了广泛的研究和应用,并收到了越来越多的支持和关注。神经调节蛋白是一类与表皮生长因子（EGF）密切相关的生长与分化因子家族。1981年,Andreasen等人用叠氮-125-I-钙调素检测牛大脑质膜中的多肽,发现一种57kD的多肽与钙调素结合呈反Ca2+依赖性,即有Ca2+时,亲和力低;有EGTA时,亲和力高。当时被称为P57。后来生化及免疫学都表明P57、GAP-43、GAP-48、B50、PP46和F1等是同一种蛋白质。为避免命名的混乱,有人建议统称为神经调节蛋白[33]。神经调节蛋白的受体是酪氨酸激酶转膜受体家族,其中包括:ErbB1/EGF、ErbB2/neu、ErbB3和ErbB4。神经调节蛋白与ErbB3或ErbB4受体结合,随即与ErbB1或ErbB4受体形成同源和异源二聚体复合物,参与细胞的增殖、分化、迁移、生长、存活以及凋亡。神经调节蛋白主要有三个亚型,I型为NRG1,也可称为heregulin（HRG）,是一个大小为44kD的糖蛋白,在神经组织、呼吸上皮组织和心内膜组织上有大量的表达。神经调节蛋白与ErbB受体结合能够促进神经元、神经胶质细胞、上皮细胞、心肌细胞和其他类型细胞的存活能力。上皮-间充质转化（EMT）过程,是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型的细胞的生物学过程[34]。最早用来描述胚胎发育早期的形态学转变,可能与肿瘤早期向侵袭性的恶性肿瘤的转变密切相关[35-39]。EMT可以减少细胞黏附分子（E-钙粘蛋白）的表达[40-43],使细胞角蛋白的细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架,在形态上具有间充质细胞的生物学特性,上皮细胞失去了细胞极性,失去了上皮表型,并获得了迁移、侵袭、抗凋亡等间质表型,EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程[44-48]。转录因子Snail超家族的锌指转录因子参与在胚胎发育期间和肿瘤进展期间获得侵袭性和迁移性的过程,这意味着明显的细胞运动。不同的家族成员也参与了赋予双侧的信号级联,以及附属器的形成、神经分化、细胞分裂和细胞存活。转录因子Snail通过在胚胎形成和肿瘤进展过程的EMT中发挥重要的作用,影响干细胞的迁移[49、50]。果蝇Snail是最早确定为Snail转录因子家族成员的,对原肠的形成和中胚层的形成有着至关重要的作用[51]。转录因子Snail超家族成员中有两条分支,一条是Scratch分子,另一条就是Snail分子[52]。在物种进化的过程中,转录因子Snail家族成员的进化是很保守的,分享高度保守的C2H2型锌指型结合域,结合到靶基因的E-box,抑制靶基因转录,对细胞分化、黏附、运动,细胞周期的调节和凋亡等具有广泛的作用[53]。很多的与EMT有关的改变的基因表达谱是转录因子Snail调控基因表达的结果,但是EMT过程中的成分被转录因子Snail调节[55-58]。一个最重要的转录因子Snail下游非直接通路包括B-连环蛋白的活性[59-61]。E-钙粘蛋白在细胞膜上隔离B-连环蛋白。转录因子Snail诱导的E-钙粘蛋白缺失释放B-连环蛋白进入细胞质,标记由（GSK3B磷化）蛋白酶体介导的分解作用[62、63]。当标准的Wnt信号通路被激活,GSK3B是被抑制的而B-连接蛋白是自由易位细胞核的,在这里通过（TCF/LEF）复合体改变基因的表达。另外通过本机制Wnt信号影响转录因子Snail下游信号通路,标准的Wnt通路能增加转录因子Snail的活性。最近的研究[64-67]显示,转录因子Snail本身就是GSK3B诱导磷酸化/分解作用的目标。细胞质的转录因子Snail半衰期很短,因为它是GSK3B诱导的磷酸化在遍在蛋白化（作用）一致的B-Trcp重叠的破坏盒基序的分解作用的目标。抑制GSK3B增加了转录因子Snail的数量,使得应答细胞核定位刺激物以及增加转录因子Snail的在细胞核中影响基因表达的时间。尽管转录因子Snail与肿瘤的侵袭和迁移目前相关[68-71],但是其在骨髓间充质干细胞中的作用和功能我们知之甚少。在本研究中,我们假设转录因子Snail与骨髓间充质干细胞的迁移力和侵袭力有关,应用转录因子Snail的过表达质粒修饰大鼠的骨髓间充质干细胞。我们在体内实验中证实了转录因子Snail上调了基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的表达,增强了大鼠的骨髓间充质干细胞的迁移能力,并通过外源性的神经调节蛋白加强了这一现象。另外,我们在大鼠的体内观察了细胞在脊髓损伤模型中的扩散情况。基于以上的发现,我们认为经过基因修饰的大鼠的骨髓间充质干细胞更易在脊髓损伤的微环境中进行细胞迁移。实验目的:一、研究神经调节蛋白（Neuregulin-1）对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）中转录因子Snail表达的影响,以确定Neuregulin-1促进骨髓间充质干细胞Snail mRNA表达的最佳浓度和最佳时间点。二、研究神经调节蛋白（Neuregulin-1）对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）侵袭力和对转录因子Snail及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的调节作用的影响。三、研究Neuregulin-1（NRG）是否促进转染了转录因子Snail的大鼠骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤动物模型的运动功能恢复。实验方法:应用相对定量PCR（qRT-PCR）方法检测Neuregulin-1在0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml浓度下分别作用大鼠骨髓间充质干细胞24小时、48小时、72小时的表达,以及检测大鼠骨髓间充质干细胞中转录因子Snail mRNA表达的情况。应用脂质体转染法将转录因子Snail过表达质粒（pBabe-puro-Snail）和阴性对照质粒（pBabe-puro）转染入大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）。MTT法验证转录因子Snail过表达质粒和阴性对照质粒的转染是否对大鼠骨髓间充质干细胞产生增殖影响。在Neuregulin-1（NRG-1）浓度为40ng/ml作用骨髓间充质干细胞48小时后,分别应用qRT-PCR方法和Western Blot方法检测转录因子Snail mRNA、基质金属蛋白酶-2 mRNA和转录因子Snail、基质金属蛋白酶-2蛋白的表达水平。Transwell细胞迁移实验检测Neuregulin-1（NRG-1）对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响情况。SD大鼠36只,制成脊髓损伤模型并随机分为A、B、C、D、E、F六组,A组为脊髓损伤后进行转染转录因子Snail的大鼠骨髓间充质干细胞和Neuregulin-1（NRG-1）联合移植（BMSC-Sna+NRG）,B组为损伤后进行转染转录因子Snail-NC的大鼠骨髓间充质干细胞和Neuregulin-1联合移植（BMSC-NC+NRG）,C组为骨髓间充质干细胞和Neuregulin-1联合移植（BMSC+NRG）,D组为转染转录因子Snail的大鼠骨髓间充质干细胞组（BMSC-Sna）,E组为转染转录因子Snail-NC的大鼠骨髓间充质干细胞组（BMSC-NC）,F组为骨髓间充质干细胞组。在脊髓损伤后4周,对各组动物进行BBB功能评分,应用SPSS12.0进行数据分析。观察统计荧光显微镜下脊髓损伤部位移植的骨髓间充质干细胞数量和扩散区域面积,并进行统计学分析。实验结果:外源性的Neuregulin-1（NRG-1）对转录因子Snail mRNA表达的促进作用具有浓度依赖性,在浓度为0ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml时促进转录因子Snail的表达,并在浓度为40ug/ml时达到转录因子Snail mRNA表达的最高峰值,而当浓度为80ug/ml时转录因子Snail mRNA的表达出现了下降的趋势。24小时、48小时、72小时都有相似的表达趋势,并具有统计学意义（P<0.05）,48小时的表达值为最高。转录因子Snail过表达质粒（pBabe-puro-Snail）和阴性对照质粒（pBabe-puro）可以成功地转染入大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）,并且没有对大鼠骨髓间充质干细胞产生增殖影响。转录因子Snail mRNA/GAPDH和基质金属蛋白酶-2 mRNA/GAPDH的表达,BMSC-Sna组、BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组存在着差异,具有统计学意义（P<0.05）,BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组没有差异,没有统计学意义（P>0.05）。Neuregulin-1（NRG-1）加药组与对照组有相同的表达趋势。转录因子Snail和基质金属蛋白酶-2蛋白水平的表达,BMSC-Sna组、BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组存在差异,具有统计学意义（P<0.05）,BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组没有差异,没有统计学意义（P>0.05）。Neuregulin-1（NRG-1）加药组与对照组具有相同的表达趋势。Transwell细胞迁移实验,BMSC-Sna组、BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组存在差异,具有统计学意义（P<0.05）,BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组没有差异,没有统计学意义（P>0.05）。Neuregulin-1（NRG-1）加药组与对照组有相同的表达趋势。转录因子Snail过表达质粒（pBabe-puro-Snail）和阴性对照质粒（pBabe-puro）可以成功地转染入大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）,并且没有对骨髓间充质干细胞产生增殖影响。转录因子Snail mRNA/GAPDH和基质金属蛋白酶-2 mRNA/GAPDH的表达,BMSC-Sna组、BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组存在差异,具有统计学意义（P<0.05）,BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组没有差异,没有统计学意义（P>0.05）。Neuregulin-1（NRG-1）加药组与对照组有相同的表达趋势。转录因子Snail和基质金属蛋白酶-2蛋白水平的表达,BMSC-Sna组、BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组存在差异,具有统计学意义（P<0.05）,BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组没有差异,没有统计学意义（P>0.05）。Neuregulin-1（NRG-1）加药组与对照组有相同的表达趋势。Transwell细胞迁移实验,BMSC-Sna组、BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组存在差异,具有统计学意义（P<0.05）,BMSC-NC组和大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）组没有差异,没有统计学意义（P>0.05）。Neuregulin-1加药组与对照组有相同的表达趋势。结论:外源性Neuregulin-1在浓度为40ug/ml时,干扰作用大鼠骨髓间充质干细胞48小时后对大鼠骨髓间充质干细胞中的转录因子Snail mRNA的表达的促进作用最强。外源性Neuregulin-1可以通过上调转录因子Snail的表达,进而促进基质金属蛋白酶-2的表达,增强了大鼠骨髓间充质干细胞的迁移能力。Neuregulin-1能够促进转染转录因子Snail的大鼠骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的运动功能恢复。