论文部分内容阅读
传统的转基因玉米新品种培育需经遗传转化、自交纯合、杂交组配及回交转育几个重要环节,通常从转化体自交纯合到回交转育获得转基因骨干自交系至少需要3～6年。作为世界玉米转基因育种最广泛使用的外植体——玉米胚性愈伤组织,其诱导率受基因型限制。就我国转基因玉米育种工作而言,大多数玉米骨干系胚性愈伤组织诱导率低,不能直接作为转基因受体材料,因而严重阻碍了我国转基因玉米育种的快速发展。miRNA是一类重要的内源性非编码RNA,它通过与靶mRNA序列部分或者完全匹配从而行使对基因的剪切、抑制翻译等,对其表达进行调控,广泛参与植物生长发育及逆境胁迫响应过程；玉米转基因育种的理论研究与无数实践均已经证明,玉米胚性愈伤组织诱导率受基因型限制。因此,本研究通过miRNA途径探讨玉米胚性愈伤组织发生率的遗传机理,以期培育更多胚性愈伤组织高诱导率的骨干亲本系,提高我国玉米基因工程育种的效率。本研究选用玉米胚性愈伤组织强诱导能力自交系18-599R为供试材料,利用solexa高通量测序技术与生物信息学分析方法,挖掘获得了大量18-599R未成熟胚经2,4-D诱导形成胚性愈伤组织过程相关的miRNA,结合荧光定量PCR和miRNA转基因过表达技术,对重要候选miRNA进行了表达检测及基因功能初步验证；并通过靶基因降解组高通量测序技术获得了胚性愈伤组织形成过程相关miRNA的靶基因信息。通过本研究,获得以下研究结果与结论：(1) solexa高通量测序共筛选获得了20个已知miRNA保守家族的78个差异表达miRNA。从对照(Control)到愈伤诱导过程的后3阶段(Stage Ⅰ、StageⅡ和StageⅢ),共有45个miRNA呈上调表达趋势,占差异表达miRNA的57.69%；下调表达的miRNA占29.49%,共计23个；另外有10个miRNA在愈伤诱导全过程中表达有上调也有下调,占12.82%。表明大多数：miRNA均以上调表达趋势参与了玉米胚性愈伤组织形成过程的调控。(2)本研究发现了13个miRNA与zma-miR167、zma-miR172、zma-miR319、 zma-miR393、zma-miR396、zma-miR397、zma-miR408和zma-miR528等8个已知的玉米miRNA家族成员序列保守性极高,经进一步生物信息学分析证实它们是这些miRNA家族的新成员。(3)通过高通量测序挖掘获得7个新miRNA,属于4个miRNA家族,分别命名为：zma-miR701、zma-miR702、zma-miR703和zma-miR704,它们在愈伤形成过程存在不同程度及类型的差异表达。这些新miRNA长度为21-22nt,位于其二级结构3’端茎部,并且均具有较低的折叠自由能和典型的二级结构。(4)通过聚类分析可将测序获得的已知家族差异表达的miRNA分为4类表达模式：下调模式、表达差异不显著模式、上调模式和显著上调模式。同样表明参与调控胚性愈伤组织形成过程的miRNA多数为上调表达模式。对这4类miRNA表达模式的进一步分析推测,Stage II(初级愈伤形成期)可能是胚性愈伤组织形成过程中重要的质变阶段,与玉米胚性愈伤组织的形成密切相关。(5)通过荧光定量PCR验证了测序结果中14个差异表达的miRNA,发现除zma-miR156a、zma-miR167a、zma-miR1671和zma-miR827等4个miRNA下调表达,其余10个均显著上调表达。另外,定量PCR验证结果同部分测序结果的相关系数达到0.94以上,证明本研究测序结果准确性较高。(6)通过降解组测序获得了213个靶基因,分别受22个已知miRNA保守家族介导剪切。这些靶基因可分为细胞组成、分子功能和生物过程三类,分别参与调节植物生长发育、转录调控、胁迫响应、激素信号传导、植物代谢途径等过程。其靶基因功能主要涉及SBP、TCP、GAMYB、ARF、F-box和GRAS等转录因子。(7)降解组结果经KO分析,发现与胚性愈伤组织形成过程密切相关的显著通路是激素信号转导途径。愈伤形成过程中共有14个靶基因在该通路中表达,分别受zma-miR160、zma-miR167、zma-miR393和zma-miR394等4个]miRNA负调控,从而调控激素信号的转导,影响内源激素合成,最终调控胚性愈伤组织的形成。(8)对转基因T1代阳性植株幼胚胚性愈伤组织诱导率的鉴定结果表明,过表达zma-miR159a和zma-miR393a的转基因植株诱导率显著或极显著低于野生型对照,证明这些miRNA确实参与调控胚性愈伤组织形成过程。