肉瘤是最常见的原发性高度恶性肿瘤之一,起源于间叶组织(包括结缔组织和肌肉)的恶性肿瘤称为“肉瘤”。多发生于皮肤、皮下、骨膜及长骨两端。肉瘤生长迅速,肿瘤晚期常有坏死、出血、切面灰红色、质均匀细如生鱼肉状,早期即可发生血行转移。骨肉瘤是肉瘤中恶性程度最高,以青年人为多,以能够产生骨样组织的梭形基质细胞为特征,好发于生长活跃的干骺端,尤以股骨下端、胫骨上端及肱骨上端最多见,约占骨恶性肿瘤的1/3。骨肉瘤发展迅速,病程短,开始在皮质内生长,可逐渐向骨髓腔发展,有时向外突破骨膜,侵入周围软组织间叶组织的恶性肿瘤。目前已经证明,肿瘤的生长和转移必须依赖于血管的生成。体积在1-2mm3舳。以下的瘤体可通过渗透作用从周围组织中获得营养,以维持自身的生存。这时肿瘤生长极为缓慢。肿瘤的进一步生长必须依赖于新生血管生成,丰富的血管网为肿瘤细胞提供充足的氧气、营养成分和肿瘤生长因子等,也是肿瘤转移的通道。血管生成能力被认为是肿瘤生长、侵袭和转移的标志。肿瘤血管生成是从已存在的血管床形成新生毛细血管的过程,包括毛细血管基底膜降解、血管内皮细胞的活化、血管基底膜及细胞外基质蛋白酶降解、内皮细胞增生及迁移增殖、管腔样结构形成融合、血管壁的重建、血流贯通等步骤。这一过程既受机体神经内分泌因素等影响,又受肿瘤细胞和肿瘤基质细胞表达的生长因子调控。肿瘤血管生成过程中涉及到多种促血管生成因子与血管生成抑制因子之间的调节失衡。这一过程不仅涉及促血管生成因子分泌增加,而且内源性血管生成抑制因子产生相应减少。目前已分离和纯化了20多种血管生成因子,主要的血管生长促进因子有血管内皮细胞生长因子(VEGF)、酸性及碱性成纤维细胞生长因子(aFGF, bFGF)、肿瘤坏死因子α、转化生长因子α/β、胸苷磷酸化酶、血小板源性生长因子、肝细胞生长因子、表皮生长因子(EGF)、血管生成素(angiogenin)、胎盘生长因子(PIGF)、粒细胞集落刺激因子、血管素、血小板激活因子、增生素、P物质,乳酸酯、透明质酸片段和前列腺素等。内源性血管生成抑制因子主要包括血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、凝血酶敏感蛋白(TSP-1)、金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、血小板因子4(PF4)、干扰素α(IFN-α)、白介素-10(IL-10)、可溶性VEGF受体(sFlt-1)、可溶性酪氨酸激酶受体(sTie-2)等。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)一种序列高度保守,高度特异性的促血管内皮细胞生长的因子,广泛分布于人和动物体内的大脑、肾脏、肝脏、脾脏、胰腺和骨骼等组织中,对内皮细胞具有强烈的细胞有丝分裂作用,刺激血管内皮细胞增殖和血管通透性增加,促进新生血管形成。VEGF通过与血管内皮细胞表面受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)特异性结合发挥生物学效应。抑制VEGF及VEGFR的活性,可以减缓或阻滞骨肉瘤侵袭和转移,骨肉瘤侵袭和转移的分子调控机制是目前骨肉瘤分子生物学研究的热点,研究表明,VEGF及VEGFR对肿瘤血管及淋巴管的生成及肿瘤侵袭和转移起重要作用。基质金属蛋白酶(matrix metallopmteinase, MMPs)是一个蛋白水解酶家族,可降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)成分。近年来随着分子生物学研究的进展,学者们对MMP的结构、功能,调控及病理生理作用已进行了较为深入的研究,MMP在肿瘤侵袭、转移中的作用越来越受重视。金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)是内源性MMP抑制剂,它通过抑制MMP活性形式及活化过程而施加双重影响。其C端功能区与MMP的其他部位结合,形成MMP-TIMP复合体,从而阻断MMP与底物结合,抑制MMP的活性,减缓或阻滞骨肉瘤侵袭和转移。骨肉瘤侵袭和转移的分子调控机制是目前骨肉瘤分子生物学研究的热点。研究表明,MMPs对肿瘤的侵袭和转移起重要作用。1971年Folkman首先提出了关于肿瘤血管形成以及通过抗血管形成抑制肿瘤生长的假设：肿瘤直径生长达到大于1-2mm3时,肿瘤细胞可以引起周围的血管内皮细胞开始增殖、迁移,在肿块内形成新的毛细血管,以保证肿瘤继续生长和转移；可以通过抑制肿瘤血管的形成来达到抑制肿瘤生长的目的,抑制肿瘤血管的形成不能消除所有的肿瘤细胞,但能阻止肿瘤细胞的生长。并在后来的实验中得时证实,从而为抑制肿瘤血管生成提供理论基础。1989年Ferrarra在牛垂体滤泡星状细胞培养液中分离纯化出来的一类糖蛋白,即血管内皮生长因子,它与肿瘤细胞分裂、生长、转移都与肿瘤血管形成有关(vascular endothelial growth factor, VEGF),1994年报道0’ Reilly博士发现了第一个内源性血管形成抑制剂Angiostatin后,又于1997年报道发现了Endostatin。2005年9月12日,我国自主研发的“重组人血管内皮抑制素”(商品名：恩度),为生物制品第一类抗肿瘤新药,它是世界上多靶点血管内皮抑制素抗癌新药。肉瘤新辅助化疗方案联合血管生长抑素在肉瘤的血管生成、侵袭和转移的目前肉瘤治疗—研究热点,为了观察肉瘤新辅助化疗方案联合血管生长抑制素对骨肉瘤中VEGF、MMPs及TIMP表达,进行动物模型研究,为临床的应用提供实验理论基础,提高肉瘤患者的无瘤生存时间。目的：1、观察S180鼠型肉瘤动物模型的肿瘤自然生长情况；2、观察顺铂联合恩度对S180鼠型肉瘤动物模型的肿瘤生长曲线及抑瘤率；3、免疫组化VEGF、MMPs及TIMP的表达与肿瘤血管生成之间的关系；方法：1、建立S180动物模型将南京大学生命科学院惠赠的液氮冻存S180细胞株连管一起迅速投入到37℃恒温水浴中,溶化1mim。室温下5mim内恢复至室温的20%胎牛血清培养基中稀释到原体积5倍,450rpm低速离心10min,去上清,转移到培养瓶中加入新鲜20%胎牛血清培养基,放入37℃,5%CO2培养箱中。复苏好的细胞接种于含10%FBS的D-MEM培养基中,于37℃,5%C02常规培养传代。隔日换液,细胞生长迅速,3-4d传1代,取对数生长期的细胞进行实验。S180细胞传代至足够数量后,收集培养好的S180骨肉瘤细胞,PBS液洗1次,调整细胞浓度,制成4×10^7/mL的细胞悬液,按4×10^6个细胞/只注入36只C57/BL6鼠后背皮下注射,每只小鼠后背皮下接种0.1ml。接种S180细胞后第6天C57/BL6鼠后背基本形成重约1g左右的实体瘤。2、对S180鼠肉瘤动物模型药物干预将36只C57BL/6小鼠模型随机分为4组,分别为：对照组、恩度组、顺铂组、顺铂+恩度联合组。每组9只,每组在接种第7天开始用药开始给药,注射部位于前肢腋窝皮下注射,给药药物剂量如下：对照组：生理盐水注射液10mg/Kg.d；恩度组：恩度10mg/Kg.d；顺铂组：顺铂5mg/Kg.d；顺铂+恩度联合组：恩度10mg/Kg·d.顺铂5mg/Kg.d,给药时间途径相同。按第1、4、7、10、13、16、19、22日共8次于前肢腋窝皮下注射药物,实验操作均遵循无菌原则。实验期间小鼠自由进食,末次给药后24h处死各组动物,剖取肿瘤标本。3、对剖取肿瘤标本进行免疫组化原理：酶标记的抗体与抗原形成抗原/一抗酶复合物,再用生物素抗体交联,其中生物素标记兔抗鼠IgM是标记有HRP(辣根过氧化物酶)和抗兔及抗鼠免疫球蛋白的多具体分子,相当于二抗,在生物素化的二抗结合一抗后,结合成抗原-抗体-生物素化二抗复合物,结合后的大分子即标记偶辣根过氧化物酶,再与DAB(3,3,-二氨基联苯胺)反应得显色。4观察指标：4.1测量移植瘤体积计算治疗后的抑瘤率自给药起第1、4、7、10、13、16、19、22天分别测量小鼠体重及肿瘤长短径,并据公式为：V=1/2 ab2(a为长径,b为短径),实验第28天处死实验小鼠,剥离肿瘤组织并测量肿瘤组织长径及短径,计算抑瘤率(tumorinhibition rate,TIR), TIR=(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%,绘制移计算肿瘤体积,得出各组的肿瘤生长曲线。4.2免疫组织化学检测移植瘤组织VEGF表达组织标本以10%甲醛溶液固定24h,常规石蜡包埋,制备5m厚切片,按免疫组化操作规程进行。用已知阳性标本作为阳性对照,以PBS代替抗作阴性对照。VEGF的阳性表达位于肿瘤细胞及血管内皮细胞,胞浆内出现黄染颗粒；对每一个切片随机选取5个高倍镜视野(×400)计数200个细胞,分别由两名病理科医师在双盲情况下对有标本进行观察,在光镜下判断其胞质的DAB染色强度,分别以0、1、2、3代表阴性、弱染色、中等染色及强染色等4个等级,H分值=[(弱染色强度细胞百分数×1)+(中度染色程度细胞百分数×2)+(强染色强度细胞百分数×3)]×100,再取两观察者的平均值作为最终H-评分,再取两观察者的平均值作为最终H-评分,H值得分介于0-300之间。4.3免疫组织化学检测移植瘤组织MMP-9表达MMP-9和TIMP阳性染色位于细胞胞浆内或胞膜出现黄染颗粒,呈棕黄色,结果采用半定量分析方法进行H-评分：对每一个切片随机选取5个高倍镜视野(×400)计数200个细胞,分别由两名病理科医师在双盲情况下对有标本进行观察,在光镜下判断其胞质的DAB染色强度,分别以0、1、2、3代表阴性、弱染色、中等染色及强染色等4个等级,H分值=[(弱染色强度细胞百分数×1)+(中度染色程度细胞百分数×2)+(强染色强度细胞百分数×3)]×100,再取两观察者的平均值作为最终H-评分,H值得分介于0-300之间。观察实验各组肉瘤动物模型中VEGF、MMPS及TIMP免疫的表达。4.4免疫组织化学检测移植瘤组织TIMP表达TIMP与MMP-9一样,阳性染色位于细胞胞浆内或胞膜出现黄染颗粒,呈棕黄色,结果与MMP-9同样的半定量分析方法进行H-评分。统计学分析所得数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。移植瘤体积定量结果用均数±标准差(X±s)表示,组间比较采用单因素的方差分析,两两组间比较采用LSD检验。各组移植瘤中的VEGF、MMP-9和TIMP的H值半定量资料均用中位数(最小值,最大值)表示,组间比较采用Kruskall-Wallis检验,两两组间比较采用Mann-Whitney U检验(检验水准采用Bonferroni法调整后的α=0.008)。以P<0.05认为有统计学意义。结果：1.移植瘤生长情况及抑瘤率瘤株肿瘤生长潜伏期均为3-5d,肿瘤呈膨胀性生长,质地略韧。对照组在治疗后第1、4、7、10、13、16、19、22天肿瘤体积平均为：395.70±34.92mm3、542.02±52.74mm3、637.48±51.69 mm3、713.88±61.78 mm3、795.39±68.88 mm3、864.14±77.63 mm3、932.244±83.27mm3、990.37±89.25mm3；恩度组在治疗后第1、4、7、10、13、16、19、22天肿瘤体积平均为：387.54±24.89mm3、506.70±28.07 mm、605.55±40.89 mm3、685.8±40.89mm3、764.48±43.98mm3、832.41±45.89 mm3、887.21±50.87mm3、930.78±52.96mm3；顺铂组在治疗后第1、4、7、10、13、16、19、22天肿瘤体积平均为：365.90±23.72 mm3、478.70±27.01mm3、553.73±34.65 mm3、580.60±40.66 mm3、551.95±37.81mm3、497.19±43.47mm3、431.43±38.81mm3、370.54±35.46mm3；联合组在治疗后第1、4、7、10、13、16、19、22天肿瘤体积平均为：392.78±42.81 mm3、477.82±47.74 mm3、524.79±38.14 mm3、534.89±22.05mm3、476.39±28.73mm3、392.15±28.73mm3、328.17±31.04mm3、275.83±32.50mm。用药后第4天对照组肿瘤依然迅速生长,恩度组较对照组略慢,仍持续性生长。顺铂组和联合组用药后第4天后肿瘤开始生长缓慢后,第7天后相对静止,而后逐渐缩小,并且随时间延长而迅速下降,与对照组及恩度组迅速增大形成鲜明对比如图所示(图3)。第22天联合组肿瘤缩小较快,顺铂组与联合组在肿瘤体积上比较有统计学意义(P<0.05)。2.免疫组化检测2.1 VRGF的免疫组化如图所示(图6-图9),对照组、恩度组的表达强度均为+++、++,而在顺铂组、联合组表达强度分别为++、+。H评分中位数(最小值,最大值)和平均秩次如表3所示。P<0.05,4组之间有统计学意义,可认为不同组合用药抑制肿瘤VRGF的表达有显著性差异。两两组间比较采用Mann-Whitney U检验,对照组与顺铂组有之间有统计学意义(P<0.008)；对照组与联合组有之间有统计学意义(P<0.008)；恩度组与联合组有之间有统计学意义(P<0.008)；顺铂组与联合组(P<0.008)；可推断对照组与顺铂组、对照组与联合组、恩度组与联合组、顺铂组与联合组VRGF的表达有差别。2.2 MMP-9的免疫组化H评分MMP-9的免疫组化如图所示(图10-图13),对照组、恩度组的表达强度均为+++、++,而在顺铂组、联合组表达强度分别为++、+。H评分中位数(最小值,最大值)和平均秩次如表3所示。P<0.05,4组之间比较有统计学意义,可认为不同组合用药抑制肿瘤VRGF的表达有差别。两两组间比较采用Mann-Whitney U检验,对照组与顺铂组、对照组与联合组、恩度组与顺铂组、顺铂组与联合组之间比较均有统计学意义(P<0.008),可以认为对照组与顺铂组、对照组与联合组、恩度组与顺铂组、顺铂组与联合组之间MMP-9的表达有差别。2.3 TIMP的免疫组化H评分TIMP的免疫组化如图所示(图14-图17),对照组、恩度组的表达强度均为+、++,而在顺铂组、联合组表达强度分别为++、+++。H评分中位数(最小值,最大值)和平均秩次如表3所示。P<0.05,4组之间有统计学意义,可认为不同组合用药抑制肿瘤TIMP的表达有显著性差异。两两组间比较采用Mann-WhitneyU检验,对照组与顺铂组、对照组与联合组、恩度组与联合组、顺铂组与联合组有之间比较均有统计学意义(P<0.008),可以认为对照组与顺铂组、对照组与联合组、恩度组与联合组、顺铂组与联合组有之间TIMP的表达有差别。结论：1、抗肿瘤药物联合恩度S180肉瘤抑制血管生成作用明显,显著抑制肿瘤体积增大,并且抑癌率高。2、肿瘤中VEGF与MMPs的表达基本平行,两者共同参与肿瘤血管的生成并协同表达,抗肿瘤药物联合恩度使瘤中VEGF与MMPs的显著降低。3、肿瘤中MMPs/TIMP比值降低可抑制肿瘤生长及侵润,恩度通过多种途经对VEGF及MMPs产生抑制作用,并增加TIMP的表达,减少肿瘤血管的生成。4、为抗肿瘤药物联合恩度治疗肉瘤临床上应用奠定实验基础,并为抗肿瘤药物联合恩度行抗血管治疗骨肉瘤动物模型,及骨肉瘤临床治疗方案开辟新治疗理念。