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背景和目的:近年来研究表明,H6亚型禽流感病毒在家禽中广泛流行并传播到哺乳动物,甚至偶尔感染人。研究表明,H6、H5、H9在家禽中共流行时,病毒可能在宿主感染过程中发生基因重配进而使病毒的某些基因特性发生改变。其中关键位点的改变促进病毒感染机制进化,导致病毒进而扩大宿主范围、增加与人型SAα-2,6Gal受体结合的几率。目前,H6N2亚型AIV的进化演变、跨种属传播及其基因特征尚未研究清楚。前期我们课题组已开展H6N1、H6N6亚型AIV体内外感染哺乳动物的研究,为进一步研究探索H6亚型AIV发生变异及跨种属传播的机制,本文将分离自水禽鸭的3株H6N2亚型禽流感病毒体内感染BALB/c小鼠、体外感染人呼吸道组织,评估其对小鼠致病性及在人呼吸道组织的复制能力并综合基因测序结果分析筛选出水禽H6N2亚型禽流感病毒感染哺乳动物小鼠和人的相关基因特征。实验方法:1.实验毒株的筛选和扩增:选择前期在广西分离的三株H6N2鸭源性禽流感病毒A/DK/GX/141/2005、A/DK/GX/3101/2018、A/DK/GX/5220/2018为实验病毒株,1株H9N2病毒A/DK/ST/3208/2010为阳性对照病毒株。4株病毒株在10 d龄鸡胚中扩增48 h,收获尿囊液测定HA值,病毒液分装、冻存于-80℃待用。2.测定病毒EID50、TCID50值并确定病毒感染量:将待测病毒按要求与对倍稀释后接种于鸡胚测定EID50（鸡胚半数感染剂量）和接种于MDCK测定TCID50（组织细胞半数感染量）,根据计算结果评估接种感染小鼠体内和人呼吸道组织体外实验的病毒量。3.H6N2亚型禽流感病毒感染BALB/c小鼠:BALB/c小鼠随机分组,分组包括:实验组、阳性对照组和空白对照组。通过滴鼻和滴眼的途径接种6-8周BALB/c小鼠,每日观察、记录症状体征,第3、5、7 d采集咽拭、每组3只麻醉采血后安乐处死,采集气管及肺组织,各组织分为2份,一份标本研磨冻存,另一份标本置于10%福尔马林固定24 h,第14 d各组最后3只小鼠麻醉采集血液后安乐处死。4.H6N2亚型禽流感病毒在人呼吸道组织复制实验:收集本校附属医院手术切除的人肺组织标本,分离支气管和肺组织,并切成小组织块,放入F-12K培养基中洗净,接种病毒液后12、24、36、48、72 h时间点分别收集组织培养上清液及组织块。5.感染后病毒的分离与血清抗体的检测:组织标本研磨后取上清液和病毒培养液标本分别接种于鸡胚和MDCK,培养48 h,HA测定病毒滴度。BALB/c小鼠血液自然凝集后收集血清,HI实验检测病毒抗体滴度。6.组织切片病理学观察和检测病毒抗原:组织标本脱水后用石蜡包埋制作成石蜡切片,用（Hematoxylin-eosin staining HE）染色观察组织标本病理变化,免疫组化实验检测组织细胞病毒抗原表达。7.病毒基因测序和分析:提取病毒RNA后反转录并进行PCR扩增,测出病毒全基因序列后用GCG 10.2编辑处理基因序列,Mega 7.0和Bioedit 7.0.9上进行序列比较。综合小鼠体内及人呼吸道组织体外感染结果,分析筛选出H6N2亚型流感病毒感染BALB/c小鼠、在人呼吸道组织复制的基因特点。实验结果:1.H6N2毒株EID50、TCID50值测定结果:3株H6N2病毒接种鸡胚中测定EID50值,测定结果显示GX141毒株能导致半数鸡胚感染对应的稀释度较其它两株病毒高,病毒感染能力较强,而GX3101和GX5220感染能力稍弱。在MDCK细胞中检测TCID50显示,GX141毒株能导致半数MDCK细胞感染对应的稀释度较其它两组高,感染能力最强,GX5220其次,而GX3101半数组织细胞感染能力最低。2.H6N2毒株对BALB/c小鼠致病力:3株病毒接种小鼠后肺组织研磨液在鸡胚中都检测出阳性结果但滴度尚无明显差异,其中GX3101和GX5220滴度为1:1024,GX141滴度为1:512。但在MDCK中培养只有GX141组检测出了阳性,滴度为1:16。气管组织只有GX141组在鸡胚和MDCK细胞中检测阳性。显微镜下观察组织病理变化,GX141和GX3101病毒感染小鼠肺组织均出现炎症细胞浸润、肺泡腔结构完整性破坏;GX141病毒感染小鼠气管组织气管黏膜细胞脱落伴炎症细胞浸润等不同程度的炎症反应。IHC显示GX141和GX3101毒株感染小鼠的肺组织细胞出现病毒NP蛋白阳性表达,GX5220则是阴性。气管组织IHC结果显示,只有GX141组气管粘膜上皮细胞出现病毒NP蛋白阳性表达。3.H6N2毒株在人体外呼吸道组织的复制:3株病毒接种体外培养肺和支气管组织,其研磨液在鸡胚和MDCK细胞中都检测出阳性结果,各组在鸡胚和细胞中培养HA滴度无明显差异。组织病理观察结显示GX141和GX3101组病毒感染小鼠肺组织出现肺泡结构破坏而GX141组支气管黏膜细胞脱落伴炎症细胞浸润等不同程度的炎症反应。IHC结果显示GX141和GX3101组的肺组织细胞出现病毒NP蛋白阳性表达,GX5220则是阴性。但支气管组织IHC结果显示,3株病毒组病毒NP蛋白均为阴性。4.病毒基因测序结果:三株H6N2病毒HA裂解位点处碱基为PQIETG/GL,显示裂解位点为单个碱基的低致病性禽流感病毒特征。GX141毒株的HA蛋白氨基酸位点出现T263K和T318L双联突变,而GX3101和GX5220仅出现E190V位点的氨基酸替换。GX141毒株显示PB1-F2蛋白出现N66S氨基酸替换。实验结论:1.H6N2亚型禽流感病毒可导致哺乳动物BABL/c小鼠感染,特别是GX141毒株同时感染气管和肺组织,提示H6N2亚型禽流感病毒可跨种属间屏障直接感染哺乳动物小鼠。2.H6N2亚型禽流感病毒在人肺组织中复制,但未能在支气管组织中复制,提示该病毒具有感染人的潜能但未能识别与结合人型SAα-2,6Gal受体3.结合上述H6N2病毒对小鼠致病性和在人肺组织的复制特点,H6N2禽流感病毒的HA蛋白氨基酸位点出现T263K和T318L双联突变及PB1-F2蛋白出现N66S氨基酸替换能促进该病毒在哺乳动物和人复制;而仅有HA蛋白E190V位点的氨基酸替换未能稳定引起H6N2亚型AIV在哺乳动物和人的复制。