研究背景在慢性乙型肝炎抗病毒治疗越来越被重视的今天,什么是治疗的入选条件?什么是评价疗效的指标?什么是停药的信号?最可靠的指标是HBVDNA。研究表明,患者的HBVDNA水平为慢性乙型肝炎急性加重时发生失代偿的独立预测因素。关于治疗指征现在国内均遵照2010年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》。但是由于历史的原因,相当一部分病人在过去的治疗中,并未按照此指南规范用药,普遍存在过度用药、使用指证不严格等现象,导致应答不佳、出现YMDD变异等不良后果。临床医生在接诊此类患者时感到非常困难,一是明确应答不佳的原因,主要是YMDD变异株的检测,二是根据是否存在YMDD变异给予针对性的补救。实际上,采取什么检测手段,既能够及时准确发现应答不佳,又能够减少患者的经济负担,可能正是努力的方向。目前存在的检测HBVDNA及YMDD变异的手段非常多,可以说各有利弊。因此,如何选择一种合适的方法值得探讨。研究目的把应答不佳的一部分病例进行两种方法的检测,即用PCR-反相点杂交法和PCR荧光法,分别检测’YIDD、YVDD、rtLl80M、rtM204V、rtM204I等指标,然后进行比较,对检测结果灵敏性、误差、费用、用时、便捷性比较,判断两种方法的优劣。研究YMDD变异占应答不佳的比例,并把基线值包括HBVDNA、ALT水平进行分析,从而找出内在联系。研究方法(1)病例选择和标本收集：病例选择的标准为：所有病例均诊断为慢性乙型肝炎,HBVDNA阳性,接受单独使用拉米夫定24周以上,24周时复查HBVDNA虽然较基线值降低1log10IU/mL但未降到检测下限。本文收集的160例慢性HBV感染者均为在安徽医科大学第一附属医院感染科及淮南市第一人民医院感染科2008年1月——2011年12月住院部或门诊部确诊的且接受拉米夫定单药治疗后应答不佳的慢性HBV感染者。(2)病毒DNA模板制备：采用经典的蛋白酶K消化-酚-氯仿方法。(3)随机抽取38例分别使用PCR荧光法和PCR反向点杂交法进行YMDD变异株和变异位点检测。然后对数据进行分析,比较两种检测方法的优缺点,从而得出结论,哪种方法更加灵敏、便捷,适用于基层医院进行YMDD变异的检测。(4)将160例患者在接受拉米夫定治疗前的基线HBVDNA和ALT值做分组分析,找出它们内在的关系。结果(1)随机抽取38例YMDD变异病例分别使用PCR荧光法和PCR反向点杂交法进行基因型、YMDD变异株和变异位点检测,发现基因B型和C型发生YMDD变异的几率无明显差异。发现主要变异位点是rtL180M+rtM204V,计20例(52.63%)。(2)用荧光PCR法检测发现有35例阳性,灵敏度92.11%。而用PCR-反相点杂交法检测发现34例为rtM204V/I阳性,灵敏度89.47%。把结果进行统计学分析,发现二者相比,差异性不显著(P>0.05)。(3)PCR反向点杂交法耗时较多、花费较大、需要仪器设备多、操作复杂、技术水平要求高、难以普遍开展,而且只能以检测位点显色与否进行定性分析,不能提供定量方面的参考。PCR荧光法不仅能检测突变类型,而且能够精确定量突变毒株在病毒群体中的比例,除了相似的灵敏性、特异性、耗时少以外,有突出的价格优势,且质控方便,所以适合对于检测精密度要求不是太高的临床实验室使用。(4)在160例应答不佳患者中,有62例(38.75%)只有野生株存在、并未发现变异株,而37例(23.13%)YMDD野生株和变异株均未检出。确定为YMDD变异的病例61例(38.13%),其中检出YVDD变异株26例(16.25%),检出YIDD变异株22例(13.75%),YVDD和YIDD同时存在5例(3.13%),变异株和野生株混合感染8例(5%)。(5)随着时间的延长,变异几率明显增加。把160例病例的基线资料做一个比较分析,发现变异率与基线ALT水平及HBVDNA水平有一定关系,即基线HBVDNA水平越高、ALT越低,发生YMDD变异几率越高。结论虽然拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的效果被无数试验证明是有效安全的,但随着疗程的延长,变异问题变得越来越严重。如果打算尽早确定YMDD变异以便采取积极干预措施,准确的检测手段必不可少。在许多检测方法中,PCR荧光法无疑是一种省时、便捷、价廉、准确性高、特异性高的检测方法,更适合基层临床使用。但是,由于本实验样本量小,所以与PCR反向点杂交法相比,准确性没有显著性差异。我们将扩大样本量,对二者的优缺点做进一步研究。