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人类钾离子通道四聚体结构域蛋白12(KCTD12,也称为Pfetin)是KCTD家族26个成员之一。KCTD12调节GABAB受体信号的激动剂效力和动力学效应。蛋白质组学分析表明KCTD12可能是判断胃肠道间质瘤预后潜在的生物标志物。然而,很少有报道关于KCTD12对其他肿瘤类型的作用。葡萄膜黑色素瘤通常指发生在脉络膜,睫状体或虹膜上的黑色素瘤。葡萄膜黑色素瘤是最常见的成人原发性眼内恶性肿瘤。在美国,这些癌症的发生率是5%,其中85%是葡萄膜原发。葡萄膜黑色素瘤患者早期表现为无痛性视力下降,后期则可导致视网膜脱离。此外,葡萄膜黑色素瘤具有高度转移性,患者黑色素瘤可能转移到肝脏,肺或者皮肤。因此,葡萄膜黑色素瘤患者有高达一半的死亡率。葡萄膜黑色素瘤肿瘤的发生和转移是复杂过程。到目前为止,尚无研究KCTD12对葡萄膜黑素瘤影响的相关研究。本课题研究旨在探讨过表达KCTD12基因对脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1的生物学功能的影响。本研究设计并亚克隆KCTD12全长和部分片段基因。构建了真核过表达载体PC3.1-KCTD12,瞬转人类脉络膜黑素瘤细胞系(OCM-1),发现过表达KCTD12可以上调肿瘤上皮组织标志蛋白E-cad的表达及降低肿瘤上皮组织间质化(EMT)标志蛋白Vimitin的表达。构建慢病毒核心质粒p LVX-Puro-KCTD12,筛选出稳定表达KCTD12的OCM-1细胞系。我们将得到的细胞系进行RNA-Sequencing检测,并对数据进行生物信息学分析。发现基因表达水平变化主要包括增殖,细胞黏附,细胞凋亡,血管生成等方面。我们也针对以上结果进行实验验证。通过MTS实验、平板克隆实验及软琼脂克隆实验,结果表明KCTD12可有效抑制OCM-1细胞的增殖。通过划痕实验、transwell侵袭迁移实验及相关蛋白的表达情况的检测,发现上皮化标志物E-cadherin,β-Catenin表达量上调,而间质化标志物Vimentin的表达量则下降,Snail及slug作为E-cadherin的调节因素,表达量也有所下降。实验结果说明过表达KCTD12可以限制OCM-1细胞的侵袭及迁移。通过流式细胞仪对细胞周期及凋亡进行检测,并对细胞周期相关的关健蛋白进行检测。蛋白检查结果发现cyclin B表达量明显下降。结果表明过表达KCTD12的OCM-1细胞中G2/M到G1期的过程时间延长。另外,KCTD12过表达OCM-1细胞抑制了裸鼠体内异种移植物的生长。最后,实验还构建了PGEX-4T-KCTD12全长和部分片段的载体,进行原核表达,并纯化了带GST及HIS标签的KCTD12全长及部分片段的融合蛋白。用全长部分蛋白验证对OCM-1细胞的生物学作用,并用部分片段蛋白免疫小鼠制备了鼠源性抗体。总的来说,过表达KCTD12具有抑制OCM-1细胞生长的作用,未来有可能作为治疗脉络膜黑色素瘤的新型治疗靶标。