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植物的O-甲基转移酶(OMTs)被认为参与了植物次生代谢产物的甲基化,尤其是在苯丙烷类和类黄酮化合物合成途径,而类黄酮代谢途径生物合成过程中的酶促反应受到转录因子的调控,有关中国水仙(Narcissustazettavar.chinensis)转录因子与花色基因的相互作用鲜有报道。本文重点克隆了中国水仙FOMTs(Flavonol-O-Methyltransferases,类黄酮O-甲基转移酶)基因并进行生物信息学分析与荧光定量PCR分析,探讨了 NtFOMTs基因的特征,并利用酵母单杂交技术(Yeast-One-Hybrid)建立中国水仙酵母单杂交文库,通过酵母单杂交实验筛选出对其有转录调控作用的转录因子,对转录因子进行分析,以期为研究中国水仙花色基因提供新的借鉴。主要研究结果如下:1.分离了类黄酮生物合成途径相关基因FOMTs:根据RNA-seq数据库筛选差异表达的中国水仙FOMT基因,共获得3条基因,采用RT-PCR与RACE技术相结合,从水仙中成功克隆出3条FOMTs基因的 cDNA 全长,分别为NtF MT1,NtFOMT2,NtFOMT3,NtFOMT。基因cDNA全长为1341bp,其中5’UTR长度为82bp,3’UTR为162bp,开放阅读框(ORF)为1098bp,编码366个氨基酸。NtFOMT2基因cDNA全长为1404bp,其中5’UTR长度为33 bp,3’UTR长度为279bp,ORF为1092 bp,编码363个氨基酸。NtFOMT3基因cDNA全长为1206bp,其中 3’UTR 长度为 117bp,ORF 为 1089bp,编码 362 个氨基酸。2.分别对NtFOMT1,NtFOMT2,NtFOMT3进行了生物信息学分析、系统进化树的构建及荧光定量表达分析:定量PCR结果分析表明,NtFOMT1在水仙花器官的不同时期差异很大,其表达模式在花瓣和副冠中均为Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ(Ⅰ:佛焰总苞形成初期;Ⅱ:佛焰总苞形成中期;Ⅲ:绿苞期;Ⅳ:盛花期);NtFOMT2与NtFOMT3表达水平趋势一致,在水仙花器官的不同时期差异很大,其表达模式表现为Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ。3.采用染色体步移技术,对NtFOMT2基因5’端调控区域进行克隆并分析:通过在线软件PlantCare对启动子顺式作用元件进行分析,结果表明,NtFOMT2基因启动子序列中除包含起始转录位点TATA-box、CAAT增强子外,还包含多个顺式作用元件,比如ACE,ATCT-motif,G-box,Sp1等多个光响应元件。此外,该启动子序列还含有MYB参与抗旱诱导的结合位点MBS元件,MYB转录因子结合位点等。4.通过酵母单杂交实验,筛选出与中国水仙FOMT2基因中MBS元件结合的候选蛋白:构建顺式元件重复序列及诱饵-受体酵母菌株,检测诱饵本底表达AbA的浓度,利用SMART技术构建并筛选酵母单杂交文库,对得到的177个阳性克隆进行分析,去除重复克隆后最终得到45个阳性克隆,经过与中国水仙本地RNA-Seq数据库和NCBI在线数据库比对后,确定了对其中5个进行点对点单杂交验证。验证结果表示,该5个均为阳性克隆。5.对得到的5个克隆进行荧光定量表达分析:荧光定量分析结果表明该5个基因在中国水仙不同发育时期均有表达且表达水平存在差异。NtGENE13、NtGENE177的表达量一致,在花瓣中均是下调模式,即不同时期表达量为Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ;在副冠中总体表达量为下调,其表达量为Ⅰ>Ⅱ>Ⅳ>Ⅲ,与NtFOMT2表达模式一致,可能对NtFOMT2进行正调控。NtGENE31、NtGENE35、NtGENE103的表达量一致,为上调模式,与NtFOMT2表达模式相反,可能对其进行负调控。