铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura and Migo)为兰科石斛属中一种药食兼用的草本植物,是我国传统名贵中药材,具有益胃生津、滋阴清热、益精补肾、壮精补虚等功效。多糖是石斛中主要的活性成分,其茎为主要用药部位。铁皮石斛资源名贵、稀缺,其茎部多糖成分的研究对医药、保健品的开发具有重大意义。本论文采用水提醇沉法从铁皮石斛根茎中提取粗多糖,尝试多种分离纯化方法,确立了两条简单高效、经济环保的提取工艺,得到精制的铁皮石斛多糖DOP-1和DOP-2。结合多种化学分析和波谱分析手段,对两种多糖的结构进行解析,并对其抗氧化活性进行了初步研究。第一部分铁皮石斛多糖DOP-1和DOP-2的制备本部分实验以产于浙江雁荡山的铁皮枫斗为原料,采用水提醇沉法提取铁皮石斛粗多糖,结合反复冻融、H2O2脱色、超滤、透析等分离纯化方法,确立了两条提取纯化工艺,分别得到两种分子量均一的铁皮石斛多糖DOP-1和DOP-2。采用苯酚-硫酸法测得DOP-1和DOP-2的糖含量分别为99.47%、97.46%;高效凝胶渗透色谱法测得两种多糖的分子量分别为4.929×105 Da、3.339×104 Da;通过紫外光谱定性扫描以及蛋白质含量定量检测,发现两种铁皮石斛多糖基本不含核酸和蛋白质;间羟基联苯法确定DOP-1和DOP-2均不含糖醛酸;采用Folin–Ciocalteu法对铁皮石斛多糖的总酚含量进行测定,结果表明DOP-1和DOP-2的总酚含量分别为147.25 mg/kg、918.67 mg/kg。通过对两种多糖的纯度鉴定可知,DOP-1和DOP-2成分均一,纯度高,满足对多糖类物质结构鉴定的要求。第二部分铁皮石斛多糖的结构鉴定本部分实验采用多种化学分析和波谱分析方法对铁皮石斛多糖DOP-1和DOP-2的结构进行解析。红外扫描图谱可确定多糖特征峰,推测主要官能团;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化法确定单糖组成;结合高碘酸氧化法、Smith降解法和甲基化分析确定糖残基连接类型及比例。一维(1H,13C)和二维(HSQC,HMBC)核磁共振图谱对铁皮石斛多糖的糖链连接类型及顺序进行进一歩确定。红外扫描图谱表明DOP-1和DOP-2均为多糖类物质,并且含有乙酰基,为乙酰化的多糖;同时,甘露糖相关吸收峰的出现,表明甘露糖为其组成成分。单糖组成结果表明两种多糖均含有葡萄糖和甘露糖,组成比分别为1.00:1.38、1.00:4.06。高碘酸氧化-Smith降解法的分析结果表明两种多糖末端连接或1,6-连接的糖残基类型含量较低,主要由氧化降解为赤藓醇的1,4-连接或1,4,6-连接的糖残基组成。甲基化分析结果表明,DOP-1的主要连接类型为1,4-连接的葡萄糖和1,4-连接的甘露糖,糖残基比例为1.00:1.78;DOP-2主要由1,4-连接的葡萄糖、1,4-连接的甘露糖和1,6-连接的葡萄糖组成,糖残基比例为1.90:14.10:1.00。结合红外扫描图谱、Smith降解GC结果以及NMR图谱的结果进行分析,表明两种多糖的乙酰基均连在1,4-β-D-Manp的2位或3位,DOP-1和DOP-2的乙酰化比例分别约为50%、30%。由于DOP-2分子量较小,溶解度高,粘度相对DOP-1低,其2D核磁检测相关峰响应较好,可通过1D和2D NMR图谱对DOP-2的结构进一步确定,并推测出DOP-2的重复结构单元。DOP-2的重复结构单元第三部分铁皮石斛多糖抗氧化活性的研究本部分实验对两种铁皮石斛多糖DOP-1和DOP-2的体外清除自由基活性以及对氧化损伤Hep G2细胞的保护作用进行研究。体外抗氧化活性的测定采用了三个抗氧化体系,包括DPPH自由基清除体系、羟基自由基清除体系和超氧阴离子自由基清除体系。结果表明,DOP-1和DOP-2对三种自由基均具有较高的体外抗氧化能力,DOP-2的羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力高于DOP-1,可能与其分子量较低、溶解度较高、甘露糖含量较高、乙酰化程度较低以及多酚含量较高有关。此外,选用H2O2建立氧化损伤细胞模型,研究铁皮石斛多糖DOP-1和DOP-2对氧化损伤Hep G2细胞存活率的影响。结果表明,DOP-1和DOP-2对氧化损伤Hep G2细胞均有一定的保护作用,在浓度为800μg/m L时,细胞存活率均达到90%以上。同时,DOP-1和DOP-2均能够降低氧化损伤Hep G2细胞内活性氧的强度,并且具有浓度依赖性。