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目的:通过比较不同人类乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)感染状态下宫颈癌外泌体Mortalin(Exo-Mortalin)表达差异,明确HPV感染通过转录因子CTCF调控Exo-Mortalin表达的上游机制;探究癌源Exo-Mortalin对永生化宫颈上皮细胞H8的恶性表型转化作用;阐释Exo-Mortalin在永生化宫颈上皮细胞H8内通过Mortalin-p53-Gadd45A通路发挥作用的下游机制。方法:利用超高速离心法提取宫颈癌细胞系外泌体,通过蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)、透射电镜(TEM)以及纳米粒子示踪分析(NTA)对外泌体进行鉴定。分别利用CRISPR/Cas9和慢病毒技术构建KoHPV-E6/E7-SiHa(Knockout-HPVE6/E7-SiHa)稳转细胞系以及 KdMortalin-SiHa/Caski(Kncokdown-Mortalin-SiHa/Caski)细胞株。利用 WB 技术检测 Exo-Mortalin、CTCF、HPVE6/E7、p53及Gadd45A的表达情况。采用荧光素酶实验验证CTCF对Mortalin的转录调控。通过免疫荧光共定位确定Mortalin的外泌体分泌途径后,运用Transwell共培实验以及EdU增殖实验、流式凋亡术等实验,证实Exo-Mortalin对H8细胞的恶性表型转化作用;体内通过建立裸鼠成瘤模型,运用免疫组化、TUNEL检测,证实Exo-Mortalin对瘤体增殖促进和对癌旁上皮细胞的恶变促进作用。利用转录组学检测,通过GO分析和KEGG富集分析找出关键靶点,再运用流式周期实验与凋亡实验探究下游Gadd45A的作用结果。结果:本研究结果分为3部分。第一部分:(1)HPV(+)宫颈癌细胞以及外泌体Mortalin表达量相比于HPV(-)上调;在敲除HPVE6/E7后,Exo-Mortalin表达降低,说明HPV的存在能够上调Exo-Mortalin表达;(2)与CTCF结合位点突变质粒相比,Mortalin基因HSPA9启动子区荧光素酶质粒的萤火虫/海肾荧光素信号比值增加,呈显著差异性(P<0.05),证实CTCF作为上游转录因子调控Mortalin的表达;(3)敲除HPVE6/E7后,CTCF表达下降;在敲低CTCF后,观察到Mortalin表达下降;结合(1)结果,说明HPV可以通过调控CTCF影响Mortalin表达;(4)H8细胞与宫颈癌细胞SiHa(HPV阳性)共培养后,迁移能力明显提高,且凋亡比例下降;使用外泌体抑制剂可阻断这一现象,说明SiHa细胞的外泌体能够促进H8恶性转变;H8细胞与敲低Mortalin的外泌体共培养后获得的增殖能力与迁移能力减弱,说明Mortalin是SiHa外泌体中对H8产生恶性转化的关键分子;(5)使用外泌体抑制剂会降低SiHa细胞Exo-Mortalin表达量,同时细胞内观察到Mortalin与CD63荧光共定位,证实Mortalin在外泌体前体存在且通过外泌体途径分泌。第二部分:(1)通过共培养实验,野生型外泌体组较于KdMortalin外泌体的克隆形成和EdU增殖能力上调,划痕距离变短,凋亡比例下降;(2)体内实验表明,宫颈癌HPV(+)野生型外泌体组处理下的瘤周上皮比KdMortalin外泌体组Mortalin表达量升高,凋亡荧光更低,并且前者血浆外泌体Mortalin表达量也升高,有显著性差异(P<0.05)。第三部分:(1)分析敲低Mortalin前后转录组表达谱变化,发现p53-Gadd45A为主要下游通路;(2)H8细胞与SiHa细胞外泌体共培养后,可观察到p53表达上调;同时通过免疫荧光对比,共培养之后H8细胞内Mortalin荧光表达与加入Exos-Mortalin的量成正比,当Mortalin降低后p53回到核内荧光增强;(3)将Gadd45A敲低后观察到H8细胞的周期活跃、凋亡比例下降,说明p53-Gadd45A在宫颈上皮细胞恶性转化中发挥了作用。结论:宫颈癌细胞内HPV能够通过释放早期感染时所募集的CTCF作为转录因子结合Mortalin基因的启动子促进Mortalin转录,进而上调Exo-Mortalin表达,因此Mortalin在宫颈癌细胞内外泌体的表达与HPV感染成正向关系。宫颈癌来源外泌体能够通过Mortalin恶性调节永生化宫颈上皮细胞H8,提高增殖、迁移能力,降低凋亡水平。在下游通路中,揭示了癌源外泌体是通过Mortalin-p53-Gadd45A调节通路作用于H8细胞的。Mortalin会结合p53同时抑制其返回核内发挥作用,从而导致宫颈上皮细胞恶性转化。