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目的:牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎重要的致病菌。研究证实,P.gingivalis牙周接种或者血液注射会加重血管壁的炎症反应,加速动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的进展。目前认为,AS是一种慢性炎症性疾病,因此抗炎治疗被认为可能是一种可行的抑制AS的治疗策略。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxisome Proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)属于核激素受体超家族,是受配体激活的转录核因子,在脂质和葡萄糖代谢中发挥重要作用,目前发现其也具有广泛的炎症抑制作用。罗格列酮(rosiglitazone,RSG)是PPAR-γ特异性的人工合成激动剂。P.gingivalis及其产物具有病原体相关分子模式(pathogen associated molecule patterns,PAMPs),能够激活宿主防御系统的Toll样受体(Toll like receptor,TLRs),从而激活下游信号传导通路如核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)。本研究拟进一步研究P.gingivalis感染促进AS形成的机制,并探索PPAR-γ激动剂罗格列酮在P.gingivalis-TLRs-NF-κB信号通路的作用。实验一:罗格列酮在牙龈卟啉单胞菌感染人主动脉内皮细胞中的抑制作用方法:体外培养人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells,HAECs),按照下列分组分别加以相应刺激:空白组、RSG组、P.gingivalis组和P.gingivalis+RSG组。实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-q PCR)检测单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、TLR-2、TLR-4和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的m RNA表达,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清MCP-1和IL-1β表达,Western Blot法检测细胞中TLR-2、TLR-4和ICAM-1表达,凝胶迁移实验(electrophoreticmobility shift assay,EMSA)法检测细胞中NF-κB活化水平。结果:P.gingivalis以浓度依赖性(MOI:0、25:1、100:1和200:1)上调HAECs中MCP-1、IL-1β、ICAM-1、TLR-2和TLR-4的表达,并促进HAECs中NF-κB活化;RSG浓度依赖性((0、2.5、5和10μM)上调HAECs中PPAR-γ的表达,RSG浓度依赖性的抑制P.gingivalis刺激的HAECs中MCP-1、IL-1β、ICAM-1、TLR-2和TLR-4的表达,并抑制P.gingivalis刺激的HAECs中NF-κB的活化。结论:P.gingivalis可能通过TLRs-NF-κB信号通路,导致HAECs炎症反应,导致内皮细胞损伤;RSG抑制P.gingivalis对TLRs-NF-κB信号通路的激活,减轻内皮细胞炎症反应。实验二:罗格列酮在牙龈卟啉单胞菌菌血症促进Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化形成中的抑制作用方法:10周龄的Apo E-/-小鼠分为:对照组、P.g组、RSG组和RSG+P.g组,分别尾静脉注射P.gingivalis活菌悬液或PBS,腹腔注射生理盐水或RSG(10mg/kg)。每周注射一次,共10次,末次注射24h后动物安乐死。ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、MCP-1和IL-1β的水平;生化法检测血清中脂质水平;取主动脉树,苏丹Ⅳ染色检测粥样斑块面积,RT-q PCR和免疫组化法检测主动脉组织PPAR-γ、ICAM-1、TNF-α、MCP-1、TLR-2和TLR-4的表达,Western Blot法检测主动脉组织TLR-2和TLR-4的表达,EMSA法检测主动脉组织NF-κB活化水平。结果:RSG治疗激活主动脉中PPAR-γ的表达,减少了P.gingivalis菌血症感染所致动脉粥样斑块面积和血清中TNF-α、MCP-1和IL-1β的水平,降低了血清中总胆固醇(total cholesterol,Tc)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-c),抑制了P.gingivalis菌血症所致主动脉组织中ICAM-1、TNF-α、MCP-1、TLR-2和TLR-4的表达和NF-κB活化水平。结论:P.gingivalis菌血症可能通过TLRs-NF-κB信号通路,引发血管局部和全身系统炎症反应,从而加速Apo E-/-小鼠AS的形成;RSG可能通过抑制TLRs-NF-κB信号通路,减少血管损伤,从而阻断P.gingivalis菌血症感染加速的Apo E-/-小鼠AS形成。实验三:罗格列酮在牙龈卟啉单胞菌牙周感染促进Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化形成中的抑制作用方法:10周龄的Apo E-/-小鼠分为4组,对照组:腹腔注射生理盐水,P.g组:牙周丝线结扎加接种P.gingivalis细菌,腹腔注射生理盐水,P.g+RSG组:牙周丝线结扎加接种P.gingivalis细菌,腹腔注射RSG(10 mg/kg),RSG组:腹腔注射RSG(10 mg/kg),实验动物每周实验一次,共10次,10周后动物安乐死,收集标本。上颌骨亚甲基蓝染色检测牙槽骨吸收情况,主动脉树苏丹Ⅳ染色检测粥样斑块面积,ELISA法检测血清中TNF-α、MCP-1和IL-1β的水平,生化法检测血清中脂质水平,RT-q PCR法和免疫组化法检测主动脉组织PPAR-γ、ICAM-1、TNF-α、MCP-1、TLR-2和TLR-4的表达,Western Blot法检测主动脉组织TLR-2和TLR-4的表达,EMSA法检测主动脉组织NF-κB活化水平。结果:P.gingivalis牙周感染导致明显的牙槽骨吸收;P.gingivalis牙周感染增加Apo E-/-小鼠主动脉粥样斑块面积;RSG激活主动脉中PPAR-γ的表达,减少了P.gingivalis牙周感染所致粥样斑块面积,抑制血液中促炎细胞因子表达,降低了血清中Tc和LDL-c,减少了P.gingivalis牙周感染所致ICAM-1、TNF-α、MCP-1、TLR-2和TLR-4的表达,抑制了P.gingivalis牙周感染所致主动脉组织中NF-κB活化。结论:P.gingivalis牙周感染可能通过TLRs-NF-κB信号通路,引发血管局部和全身系统炎症反应,Apo E-/-小鼠AS的形成;RSG可能通过TLRs-NF-κB信号通路,抑制机体炎症免疫反应,从而阻断P.gingivalis牙周感染加速的Apo E-/-小鼠AS形成。