第一部分GSPB2对内皮细胞糖基化损伤保护作用的研究研究背景随着社会经济的发展和人民生活水平的提高,生活方式的改变和社会人口老龄化,糖尿病患病率在世界范围内呈上升趋势,已经成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的又一严重危害人类健康的全球公共卫生问题。糖尿病不仅仅以持续性的高血糖为其特点,更重要的是高血糖所带来的血管并发症的损害。血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)是人体血管壁的第一道屏障,调节着血管的结构和功能,VEC是最早受到高血糖影响的部位,高血糖可抑制内皮细胞的迁移、增殖和血管发生变化；大量的研究证实：内皮功能障碍包括血管舒张因子与血管收缩因子、抗凝介质与促凝介质或生长抑制因子与生长促进因子之间的不平衡在VR的发生发展过程中起着关键作用。因此,血管早期损伤机制的阐明有助于预防或延缓糖尿病血管重构的发生和发展,并且VEC作为血管重构的干预点具有良好前景,开辟新的糖尿病血管并发症治疗途径具有重要意义。葡萄子原花青素(grape seed proanthocyanidin extracts, GSPE)是从葡萄子中提取的一种天然多酚类化合物,是迄今为止所发现的最强效的自由基清除剂之一,具有强大的抗氧化、抗非酶糖基化活性,并具有强效的心血管保护作用；其作为一种天然植物成分,无明显的毒性反应,在国内外的应用非常广泛,其中二聚体在各类原花青素中分布最广,抗氧化活性最强。葡萄子原花青素B2 (grape seedprocyanidin B2, GSPB2)是GSPE的主要成分,由两个单体(儿茶素或表儿茶素)C4→C8键合而成的二聚体,在8种异构体中原花青素B2的活性最强。多年来,国内外众多学者一直致力于GSPE的作用机制研究。但是,至今尚未明确GSPB2对糖尿病血管内皮细胞糖基化损伤保护作用的机制研究。在目前的研究中,观察糖基化终末产物对人脐静脉内皮细胞的影响以及探讨GSPB2对其的保护作用,并进一步研究乳凝集素(lactadherin)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)信号通路在GSPB2抗内皮细胞糖基化损伤中的调节机制,将为防治糖尿病血管并发症乃至多种涉及血管重构的疾病开辟新的途径。研究目的1.研究GSPB2对血管内皮细胞糖基化损伤的保护作用。2.研究GSPB2对乳凝集素和GSK3β表达的影响。研究方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),加入不同浓度的GSPB2(0.78、1.56. 3.12.6.25、12.50、25.00、50.00μmol/L)孵育48小时,应用MTT和CCK-8比色法测定HUVEC的细胞生存率,从而确定实验中GSPB2的使用浓度。将GSPB2溶液加入HUVEC中,终浓度为(2.5、5.0、10.0μmol/L),预孵育1小时,然后加入糖基化终末产物(AGE-BSA,200μg/ml)继续共同培养至48h。应用CCK-8比色法测定HUVEC的细胞生存率,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞内活性氧簇(ROS)的形成,实时定量PCR或Western blot技术测定各组细胞lactadherin、cleaved caspase 3、caspase 3、磷酸化GSK3β(ser9)和总GSK3β的表达。研究结果1. GSPB2对HUVEC细胞存活率的影响不同浓度的GSPB2孵育48小时后,HUVEC的细胞生存率在GSPB2浓度≤12.5μmol/L较正常细胞增加,GSPB2在浓度为6.25μmol/L时HUVEC细胞生存率较正常显著增加(P<0.05)。并且当GSPB2浓度超过25.00μmol/L时HUVEC细胞生存率较正常显著降低(P<0.05)。2. GSPB2对AGEs刺激HUVEC细胞存活率的影响与正常细胞组相比,AGEs显著降低HUVEC的细胞存活率(P<0.01)。应用不同浓度的GSPB2 (2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC预孵育后,能够显著改善AGEs刺激HUVEC的细胞生存率(P<0.05或P<0.01)。3. GSPB2对AGEs刺激HUVEC细胞凋亡的影响与正常细胞组相比,AGEs显著增加HUVEC的细胞凋亡(P<0.01)。应用不同浓度的GSPB2 (2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC预孵育后,能够显著降低AGEs刺激HUVEC的凋亡(P<0.05)。4. GSPB2对AGEs刺激HUVEC细胞内ROS的影响与正常细胞组相比,AGEs刺激HUVEC 0.5小时后,显著增加细胞内ROS的形成(P<0.05)。应用不同浓度的GSPB2 (2.5、5.0、10.0μmol/L)和HUVEC预孵育后,能够呈剂量依赖性的显著降低AGEs刺激HUVEC的ROS形成(P<0.05)。5. GSPB2对AGEs刺激HUVEC的cleaved caspase 3和lactadherin表达影响AGEs刺激HUVEC 48小时后,cleaved caspase 3和lactadherin蛋白表达与正常细胞相比显著增加(P<0.05)。经不同浓度GSPB2预孵育后能够显著降低AGEs刺激HUVEC的cleaved caspase 3和lactadherin蛋白的表达,呈剂量依赖性(P<0.05)。同时应用实时定量PCR测定各组细胞lactadherin mRNA的表达,AGEs刺激HUVEC 48小时,lactadherin mRNA的表达也显著增加(P＜0.05), GSPB2能够剂量依赖性的抑制lactadherin mRNA的表达(P<0.05)。6. GSPB2对AGEs刺激HUVEC的磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表达影响AGEs刺激HUVEC 48小时后,磷酸化GSK3β(ser9)表达显著降低(P<0.05),经不同浓度GSPB2预孵育后能够显著增加AGEs刺激HUVEC的磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表达(P<0.05)。结论1. AGEs刺激HUVEC引起细胞凋亡,使lactadherin, cleaved caspase 3表达增高,经不同浓度GSPB2预孵育,能够抑制HUVEC损伤,起到保护作用。2. GSPB2保护内皮细胞糖基化损伤的分子机制：可能通过抑制lactadherin和增加磷酸化GSK3β(ser9)蛋白表达有关。第二部分Lactadherin介导的GSPB2抗内皮细胞糖基化损伤机制的研究研究背景糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)是体内蛋白质中赖氨酸的氨基部分、脂类或核酸与还原糖的羰基在无酶的条件下发生反应,形成Schiff碱,经Amadori反应重排后形成的相对稳定的糖基化产物。近来研究发现,糖尿病患者血中AGEs水平明显增高,且随着病程的延长AGEs浓度也逐渐增加。AGEs具有广泛的生物学活性,参与糖尿病血管并发症的发生和发展。在血管壁的聚集直接参与了血管病变的形成。同时,AGEs还与血管壁细胞膜上AGEs受体结合,激活与血管损伤相关的机制,最终导致血管损伤。但是,AGEs导致血管内皮细胞损伤机制尚未阐明。我们通过第一部分研究发现,AGEs刺激血管内皮细胞导致乳凝集素(lactadherin)表达增高,经GSPB2干预后其表达呈剂量依赖性降低；前期通过蛋白质组学和分子生物学技术发现：在糖尿病大鼠主动脉组织中lactadherin表达显著增加,经GSPE干预后,其在主动脉组织中表达明显降低。乳凝集素又称为乳脂肪球表皮生长因子8 (MFG-E8)是乳汁脂肪小球表面的亲脂性糖蛋白,在机体其他体液中也有表达,发挥多种功能,并与体内多种细胞的整合素受体结合,引发粘附、分化、增殖、凋亡、细胞骨架重排、激酶级联反应等。它主要分布于乳小管顶端的分泌上皮,并在乳腺癌中过度表达；并且也存在于胰腺、主动脉内皮细胞和平滑肌细胞、巨噬细胞及树突状细胞等。本研究首先构建lactadherin过表达慢病毒载体和siRNA,转染HUVEC后,并应用GSPB2干预,测定干预前后内皮细胞凋亡变化,并应用分子生物学技术检测lactadherin、cleaved caspase 3、Bax/Bcl-2和磷酸化GSK3β(ser9)表达变化。研究目的1.研究lactadherin siRNA和过表达对内皮细胞糖基化损伤的影响。2.研究GSPB2抗内皮细胞糖基化损伤的分子调控机制。研究方法体外培养HUVEC,构建lactadherin siRNA和过表达载体,成功转染HUVEC后,传代扩增。将转染阴性对照和lactadherin siRNA的HUVEC分别加入糖基化终末产物(AGE-BSA,200μg/ml)继续共同培养至48h,阴性对照同时加入GSPB2 (10.00pmol/L)共孵育；另外,将lactadherin过表达的HUVEC,加入GSPB2 (10.00μmol/L)孵育48小时,应用MTT和CCK-8比色法测定各组细胞生存率,TUNEL法检测细胞凋亡,并收集lactadherin过表达的HUVEC,各组细胞应用电镜观察细胞超微结构变化,应用实时定量PCR或Western blot技术测定各组细胞lactadherin、cleaved caspase 3、磷酸化GSK3P和线粒体凋亡通路Bax/Bcl-2表达变化。研究结果1. Lactadherin siRNA和过表达转染HUVEC的有效性转染的有效性应用荧光显微镜、实时定量PCR和western blot技术评价。转染阴性对照组(NC)、lactadherin siRNA组(LsiRNA)、表达GFP基因组(LV-C)和GFP及lactadherin过表达组(LV),收获各组细胞。转染有效性约为95%,lactadherin siRNA在转染后48小时LsiRNA lactadherin蛋白表达较NC降低60%以上；lactadherin过表达在转染5天后,lactadherin蛋白表达量较LV-C增加超过2倍。2. Lactadherin对AGEs刺激HUVEC细胞生存率的影响及GSPB2干预作用HUVEC转染GFP基因或阴性对照并未影响细胞生存率。AGEs (200μg/ml)刺激各组细胞48小时,与AGEs刺激NC组细胞相比,LsiRNA能够显著改善AGEs诱发的细胞生存率的降低(P<0.05); GSPB2 (10μmol/L)共孵育48小时也能够显著改善AGEs诱发的细胞生存率的降低(P<0.05)。另外,转染5天后,LV组细胞生存率较LV-C组显著降低(P＜0.05), GSPB2 (10μmol/L)共孵育48小时能够显著改善LV组细胞生存率(P<0.05)。3. Lactadherin对AGEs刺激HUVEC细胞凋亡的影响及GSPB2干预作用AGEs (200μg/ml)刺激各组细胞48小时后,与AGEs刺激NC组细胞相比,LsiRNA能够显著改善AGEs诱发的细胞凋亡(P<0.05); GSPB2 (10μmol/L)共孵育48小时也能够显著改善AGEs诱发的细胞凋亡(P<0.05)。另外,转染5天后,LV组细胞凋亡较LV-C组显著增加(P<0.05), GSPB2 (10μmol/L)共孵育48小时能够显著改善LV组细胞凋亡(P<0.05)。4. Lactadherin过表达HUVEC超微结构的改变透射电镜扫描观察Lactadherin过表达转染5天后及GSPB2共孵育48小时细胞超微结构改变,LV组细胞凋亡显著增加,可见凋亡小体、线粒体偏极化、细胞染色质固缩及染色体聚集于核膜呈境界分明块状等变化,GSPB2共孵育后细胞凋亡显著减轻。5. Lactadherin对AGEs刺激HUVEC的cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值影响及GSPB2干预作用LV-C组、LV组、LsiRNA组和NC组细胞uncleaved caspase-3表达未见显著变化。AGEs (200μg/ml)刺激各组细胞48小时后,与AGEs刺激NC组细胞相比,LsiRNA能够显著改善AGEs诱发的细胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P＜0.05); GSPB2 (10μmol/L)共孵育48小时也能够显著改善AGEs诱发的细胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P<0.05)。另外,转染5天后,LV组细胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值较LV-C组显著增加(P<0.05),GSPB2 (10μmol/L)共孵育48小时也能够显著改善LV组细胞cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值的增加(P<0.05)。6. Lactadherin对AGEs刺激HUVEC磷酸化GSK3β(ser9)的影响及GSPB2干预作用AGEs (200μg/ml)刺激各组细胞48小时后,与AGEs刺激NC组细胞相比,LsiRNA能够显著改善AGEs诱发的细胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)；GSPB2(10μmol/L)共孵育48小时也能够显著改善AGEs诱发的细胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)。另外,转染5天后,LV组细胞磷酸化GSK3β(ser9)较LV-C组显著降低(P≤0.05), GSPB2 (10μmol/L)共孵育48小时能够显著改善LV组细胞磷酸化GSK3β(ser9)的降低(P<0.05)。结论1. Lactadherin在AGEs诱发的血管内皮细胞凋亡中起着重要的作用。2. Lactadherin介导的血管内皮细胞凋亡与线粒体凋亡通路和GSK3β(ser9)的磷酸化有关。3.抗氧化剂GSPB2通过抑制Lactadherin表达起到减轻内皮细胞糖基化损伤。