棉花纤维是由胚珠部分表皮细胞分化,经历起始、伸长、次生加厚和成熟四个完全不同但又部分重叠的发育阶段发育成的单细胞纤维,在此过程中,纤维细胞伸长了1000～3000倍。微丝骨架的动态变化为细胞的快速轴向扩张提供导向和网络支撑,运送营养物质和进行信号传递。因此,微丝骨架是棉花纤维发育的重要影响因素之一。可以与微丝结合的蛋白(ABP)多达160多种,它们可以与微丝单体、多聚体结合,参与微丝的聚合、解聚、稳定性、排序、捆绑、网络化、碎片化、解体,调控微丝骨架,从而调控植物的生长发育和抗逆性。植物的肌动蛋白解聚因子(ADF)、肌动蛋白抑制蛋白(Profilin)、丝束蛋白(Fimbrin)等ABP对微丝骨架的调控作用有不少报道,近年来,在拟南芥、水稻、烟草中发现绒毛蛋白(villin)基因对于细胞伸长和形态形成、非生物胁迫等起调控作用。但是尚无棉花villin基因的报道。本实验室曾以纤维伸长受阻的突变体Li-1(李氏无纤维)和其野生型的近等基因系TM-1为材料,分析了开花后4d、8d(DPA)纤维的蛋白质组差异,鉴定了一个在Li-1纤维中下调表达的蛋白质。编码该蛋白质的基因被克隆并被命名为GhVLN。将该基因转入裂殖酵母使得酵母显著增长,长宽比显著变大。因此,推测蛋白质可能与细胞伸长有关,对于棉花纤维的伸长起调控作用。为了验证GhVLN对于细胞骨架和棉纤维发育的影响,本文开展以下研究:1、将棉花GhhVLN基因ORF全长构建到35S-pBI121表达载体,用农杆菌浸花法将它们导入拟南芥。经过卡那霉素(Kan+)抗性筛选及PCR检测,获得了转GhVLN基因拟南芥5株阳性植株。通过对转基因拟南芥的观察发现,相比于野生型拟南芥,GhhVLN过表达的转基因拟南芥植株根长增长,侧根增多,根毛变多、变长。GhhVLN对拟南芥根系和根毛的发育具有显著的促进作用。150 mM盐胁迫处理下,GhhVLN过表达转基因拟南芥根系伸长受抑制的程度轻于野生型拟南芥,GhVLN可以提高植物的耐盐性。2、构建了 pBI121-GhVLN重组植物过表达载体,采用农杆菌介导的方法转化棉花。观察并记录组织培养各个时期的特征,目前已经诱导出胚性愈伤组织并初步获得了转基因棉花T0代阳性再生植株幼苗,阳性苗的嫁接正在进行。为研究微丝骨架及该基因在棉花发育中的功能奠定了基础。3、将GhhVLN基因全长加上六联组氨基酸标签克隆至pET30原核表达载体上,IPTG诱导下,GhVLN大量表达,SDS-PAGE电泳检测其分子量大约为110kDa,与理论分子量一致。通过优化GhVLN基因原核表达诱导条件,获得了高浓度可溶性GhVLN蛋白,利用Ni-NTA镍柱纯化获得GhVLN蛋白,GhVLN蛋白体外可以使F-actin成束。