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研究背景:液体活检是一种非常有前景的非侵入性的检测手段,广泛应用于肿瘤的早期诊断、疗效评估、复发监控等;其检测对象为从原发肿瘤和/或转移性沉积物释放到外周血中的循环肿瘤细胞和无细胞循环核酸。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)是肿瘤早期诊断、治疗及预后检测等方面最有前途的生物标志物之一,其携带肿瘤的基因突变和甲基化信息等,这些信息有助于肿瘤的诊断、定位、耐药情况分析等。ct DNA的检测技术主要分为PCR技术和测序技术两大类。微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR,dd PCR)检测灵敏度高,但高成本、低通量制约了其广泛的临床应用。传统PCR和荧光定量PCR是目前临床应用最广的基因突变检测平台,但是PCR方法对于ct DNA或者稀有突变的检测具有很大的局限性。虽然,在PCR基础上改良的稀有突变检测技术,如AMRS-PCR(Amplification Refractory Mutation System-PCR)、COLD-PCR(Coamplification at Lower Denaturation Temperature PCR)等对稀有突变的检测灵敏性提高到1%,甚至0.1%,但是对于ct DNA的检测尤其是早期检测还是远远不足的。BRAF基因的V600E是甲状腺乳头状癌、结直肠癌常见的突变类型,其可作为一种液体活检的标志物用于肿瘤的早期诊断、疗效跟踪、个体化治疗等。目前对于BRAF基因的V600E的PCR检测技术难以满足ct DNA的检测需求。本研究拟开发一种基于PCR反应的突变检测技术,提高ct DNA的检测灵敏度。目的:本研究拟结合PCR技术和热稳定性的限制性内切酶建立一种简单、低成本、高灵敏度的基于PCR平台的ct DNA检测技术。并以BRAF基因最常见的突变类型V600E为模型,评价该技术的临床应用前景。方法:1.通过定点突变的方法构建BRAF V600E的野生型和突变型质粒,作为人工模板用于方法的建立和优化。2.通过优化选择能同时满足DNA聚合酶和热稳定性限制性内切酶Tsc AI的反应缓冲液。3.建立基因型转换突变富集技术,并用不同突变比例的模板评价该技术对稀有突变检测的灵敏度。4.分别收集到我院进行手术治疗的甲状腺乳头状癌患者的血液标本和组织标本,血液标本提取ct DNA用于基因转换突变富集技术的临床应用评价,组织突变分析结果作为金标准。结果:1.本研究建立的基因转换突变富集技术是在BRAF基因片段PCR扩增的体系中加入热稳定性的限制性内切酶Tsc AI,Tsc AI所识别并切割的酶切位点正好与BRAF V600E的野生型片段一致。因此,当基因型为野生型时,其模板或PCR产物将被酶切消化,而基因型为突变型时,由于序列改变使得前置性内切酶的酶切效率大大的降低。经过边扩增边酶切的反应,野生型片段被切割无法扩增,产物越来越少;而突变型片段得以扩增富集。2.该技术选择Qiagen公司的Hot Star Taq Plus DNA聚合酶和热稳定性的限制性内切酶Tsc AI为双酶组合,在Fast Digest Buffer中进行PCR和酶切反应。基因型转换突变富集技术的反应程序是在传统的PCR程序的延伸步骤后增加一步65℃酶切2min的步骤。3.在模拟体系下,基因转换突变富集技术能够最低检测到野生模板:突变模板为100000:1,其检测灵敏度达到0.001%。4.临床cf DNA的检测结果与组织突变分析结果一致。结论:结合PCR和热稳定性的限制性内切酶Tsc AI建立了一种基因型转换突变富集技术应用于血浆中BRAF V600E的ct DNA检测。