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研究背景近几年,随着人们生活水平的提高,乳腺癌的发病率也迅速的增长着,目前乳腺癌已逐步成为女性发病率最高的恶性肿瘤之一,对女性的健康造成严重危害[1]。乳腺癌的治疗模式随着循证医学和分子生物学的飞速发展,已经从传统的手术治疗转变为现在的多种方式综治疗治疗,乳腺癌患者的预后得到显著改善。但是由于乳腺癌细胞的侵袭迁移和对靶向药物及化疗药物的耐药,导致乳腺癌患者最终复发转移。所以寻找乳腺癌有效的治疗靶点和预后预测因子,将会为乳腺癌的治疗提供新的策略。14-3-3蛋白家族广泛表达于真核生物细胞,是一类高度保守的小分子多功能酸性二聚体蛋白。14-3-3蛋白家族包括由七个不同基因编码而成的七个亚型(β、γ、ε、σ、ε、ζ和δ),它们在调控细胞内信号转导、新陈代谢、细胞周期与凋亡等方面发挥作用[2]。现有研究表明,14-3-3蛋白家族的七个亚型中唯有14-3-3θ可以通过减少真核细胞核输出核转录因子kappa B(NF-κB)从而发挥对肿瘤的抑制作用[3],其他亚型分别与不同肿瘤细胞的侵袭、增殖、迁移正相关[4]。脑膜瘤中14-3-3θ亚型高表达,并随着脑膜瘤的恶性程度升高其表达水平逐步增加,14-3-3θ与脑膜瘤的恶化相关[5]。有研究提示14-3-3θ的表达与乳腺癌淋巴结转移正相关,推测14-3-3θ可能是乳腺癌侵袭转移的一个潜在预测分子[6]。但是14-3-3θ对乳腺癌生物学行为的影响及其潜在的分子机制仍不明确。那么14-3-3θ对乳腺癌细胞的增殖、周期和凋亡有何影响?14-3-3θ与乳腺癌的预后有无关联?14-3-3θ能否成为乳腺癌新的治疗靶点?带着这些问题,我们首先构建并筛选了过表达14-3-3θ的乳腺癌细胞,然后进行了14-3-3θ对乳腺癌细胞生物学行为影响及其机制的探索。研究方法和结果1.构建并筛选过表达14-3-3θ的乳腺癌细胞系:将订购的p ENTR 3C DUAL载体中14-3-3θ基因重组至真核表达质粒载体pc DNA4.0中,用重组后的真核过表达载体pc DNA4.0-14-3-3θ转染293T细胞,western blot进行鉴定,将重组成功的真核表达载体pc DNA4.0-14-3-3θ转染AU-565、MCF-7和BT-474,抗生素筛选,经过筛选的乳腺癌细胞通过western blot鉴定,成功构建过表达14-3-3θ的乳腺癌细胞系。2.14-3-3θ对乳腺癌细胞生物学行为影响的研究:(1)western blot实验检测14-3-3θ在五株乳腺癌细胞系中的表达水平(2)MTT实验分别检测MCF-7和AU-565过表达14-3-3ζ后的细胞增殖活性的变化;(3)平板克隆实验分别检测MCF-7和AU-565过表达14-3-3θ后克隆形成能力的变化;(4)流式细胞仪分别检测MCF-7和AU-565过表达14-3-3θ后细胞凋亡的差异变化;(5)划痕实验分别检测MCF-7和AU-565过表达14-3-3θ后细胞迁移能力的变化;(6)分别通过用过表达14-3-3θ的乳腺癌细胞MCF-7和AU-565荷瘤裸鼠,观察实验14-3-3θ表达升高与否对裸鼠移植瘤生长的作用,取瘤体行免疫组织化学染色,观察相应指标的变化。结果:14-3-3θ在五株乳腺癌细胞系中表达存在差异,这种差异可能和乳腺癌细胞的恶性程度相关。14-3-3θ的表达升高可以促进乳腺癌细胞增殖、迁移、克隆形成能力、减少乳腺癌细胞的凋亡以及促进裸鼠移植瘤的生长,综上所述,14-3-3θ可以促进乳腺癌的恶性生物学行为。MCF-7和AU-565过表达14-3-3θ后对阿霉素,他莫昔芬,赫赛汀敏感性的变化研究:细胞杀伤曲线分别检测MCF-7和AU-565过表达14-3-3θ后对不同浓度梯度阿霉素,他莫昔芬,赫赛汀敏感性的变化。结果:14-3-3θ表达升高可以降低MCF-7对阿霉素的敏感性,能够降低ER阳性乳腺癌细胞MCF-7对他莫昔芬的敏感性,还可以降低HER-2阳性乳腺癌细胞AU-565对赫赛汀的耐药性。14-3-3θ过表达引起HER-2阳性乳腺癌细胞AU-565对赫赛汀的敏感性差异最为明显。3.14-3-3θ表达升高引起乳腺癌对阿霉素、他莫昔芬及赫赛汀敏感性降低的机制初探:(1)western blot检测14-3-3ζ表达升高与否对AU-565和MCF-7对m TOR、p-m TOR、Akt、p-Akt等蛋白表达水平的影响。用赫赛汀分别处理表达不同水平14-3-3θ的AU-565,western blot检测Bcl-2、Bax和PARP等相关蛋白表达的变化;(2)分别用表达不同水平14-3-3ζ的HER-2阳性乳腺癌细胞BT-474注射裸鼠成瘤,然后给予裸鼠赫赛汀处理,观两组裸鼠瘤体对赫赛汀治疗的敏感性,取瘤体免疫组织化学染色观察相应蛋白的表达差异。结果:14-3-3θ降低乳腺癌细胞对阿霉素、他莫昔芬及赫赛汀的敏感性作用可能与Akt和m TOR的活化增多有关,其中14-3-3θ的过表达能够下调HER-2阳性乳腺癌对赫赛汀的敏感性很可能与Akt和m TOR的活化增多,凋亡相关蛋白Bcl-2与PARP的表达升高,Bax表达下降有关。结论1.五株乳腺癌细胞系14-3-3θ的表达水平存在差异,这可能与乳腺癌细胞的恶性程度相关,有待进一步研究。2.14-3-3ζ可以促进乳腺癌细胞的恶性生物学行为。3.14-3-3θ表达升高可以在一定程度上降低乳腺癌细胞对阿霉素、他莫昔芬及赫赛汀抗治疗的敏感性,其中赫赛汀最为明显,14-3-3ζ这一作用机制可能与Akt-m TOR通路的活化增加有关。