【背景】胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤,化疗在其综合治疗中发挥着极其重要的作用。但是,在临床上存在着化疗药物可以使肿瘤迅速缩小,但对患者生存期延长不明显的悖论。造成这一现象的重要原因是肿瘤细胞的多药耐药及其导致的肿瘤细胞恶性表型的进展。既往有研究发现化疗药物可以通过诱导肿瘤细胞发生EMT、改变肿瘤微环境以及富集肿瘤干细胞等途径促进多种肿瘤的侵袭转移。但是,化疗在促进胃癌细胞侵袭转移中的作用研究尚不充分。分泌蛋白质组学是以分泌和脱落的细胞膜蛋白为主要研究对象的蛋白质组学重要分支,其在肿瘤研究中的应用极大的推动新型肿瘤标志物的发现,也为阐明肿瘤发生发展的机制提供了新的技术手段。【目的】通过分泌蛋白质组学方法筛选促进胃癌多药耐药细胞侵袭转移的候选分子并明确其作用机制【方法】1.采用Transwell和裸鼠尾静脉注射肺部转移实验检测胃癌多药耐药和亲本细胞侵袭转移能力的差别;采用非标定量蛋白质谱技术筛选胃癌耐药和亲本细胞无血清条件培养基中差异分泌蛋白,并与既往基因芯片筛选结果对比分析取交集;采用q RT-PCR和Western blot技术对筛选结果在胃癌及其他肿瘤的耐药细胞系中进行验证;采用公共数据库查询候选分子在肿瘤中表达的临床意义;在胃癌细胞系和PDX裸鼠模型中检测化疗药物能否诱导候选分子表达。2.采用Transwell和尾静脉注射体内转移实验在耐药和亲本胃癌细胞中检测下调和过表达ADAM22对细胞侵袭转移能力的影响。3.采用q RT-PCR和Western blot技术检测EMT经典标志物的表达;采用体外黏附实验检测干预ADAM22表达对细胞对细胞外基质Fibronectin和CollagenⅠ黏附能力的变化并采用免疫荧光技术检测黏着斑标志物和F-actin纤维形成情况;采用尾静脉注射荧光标记肿瘤细胞技术检测干预ADAM22对肿瘤细胞在裸鼠肺内驻留能力的影响;采用体外穿内皮实验检测干预ADAM22表达对肿瘤细胞穿过内皮细胞能力的影响;采用Matrigel-on-Top(Mo T)3D培养技术检测干预ADAM22对单个肿瘤细胞克隆形成及丝状伪足样凸起(FLPs)形成能力的影响。4.采用Western blot技术检测下调ADAM22表达对黏附相关分子和Integrinβ1(ITGB1)表达和活性的影响;采用GST-pulldown联合Western blot技术检测下调ADAM22表达对胃癌耐药细胞中Rac1和Cdc42活性的影响;在下调ADAM22表达的耐药细胞中分别检测ITGB1激活抗体对细胞黏附、体内外侵袭迁移能力的影响;采用免疫共沉淀联合Western blot技术检测野生及突变型ADAM22与ITGB1的相互作用;采用针对ADAM22 m RNA 5’-UTR的si RNA下调内源性ADAM22表达后,验证野生和突变型ADAM22对耐药细胞黏附、迁移和3D克隆形成能力的补救作用。5.采用MTT法检测下调ADAM22、Rac1及Cdc42后耐药细胞针对多种化疗药物IC50的变化;采用q RT-PCR和Western blot技术检测检测下调ADAM22、Rac1和Cdc42后HIF1α和ABCB1 m RNA及其编码蛋白表达水平变化。6.采用免疫组织化学染色技术检测ADAM22和HUTS4在胃癌组织原发灶和转移灶中的表达情况;采用非参数统计方法分析ADAM22在胃癌原发灶和转移灶中表达强度的变化;采用Spearman秩相关分析ADAM22和HUTS4在胃癌组织中表达的相关性;采用Kaplan-Meier生存分析和Cox回归模型分析ADAM22和HUTS4在胃癌组织中表达的临床意义。【结果】1.Transwell和尾静脉注射实验结果表明胃癌耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR的体内外侵袭转移能力明显增强;同时,在尾静脉转移实验中我们发现,耐药细胞不仅成瘤率高,而且转移灶的数目和体积也较亲本细胞明显升高。非标定量质谱鉴定了91个在2株耐药细胞无血清条件培养基中含量明显升高的分泌蛋白,通过与既往基因芯片结果对比发现其中23个m RNA水平也明显升高。q RT-PCR和Western blot验证结果证实了ADAM22在2株胃癌耐药细胞以及K562和口腔鳞癌等多种肿瘤的耐药细胞中表达升高。通过查询Kaplan-Meier Plot数据库我们发现ADAM22高表达与胃癌患者预后不良相关。q RT-PCR和免疫组化结果表明多种化疗药物可以诱导胃癌细胞系和PDX肿瘤组织表达ADAM22。2.Transwell和尾静脉注射实验结果表明下调ADAM22表达后胃癌耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR的体内外侵袭转移能力受到明显抑制。特别需要指出的是在尾静脉注射实验中耐药细胞不仅成瘤率明显下降,肿瘤转移灶的数量和尺寸也明显下降。3.q RT-PCR和Western blot结果表明EMT经典标志物E-cadherin和Vimentin表达不受ADAM22影响。下调ADAM22后耐药细胞SGC7901/ADR和SGC7901/VCR对细胞外基质蛋白Fibronectin和CollagenⅠ的黏附能力明显下降,在肺部驻留能力也受到显著抑制。免疫荧光结果表明下调ADAM22后耐药细胞黏着斑和F-actin纤维形成受到明显抑制。同时,耐药细胞的体外内皮穿过能力和Mo T培养条件下的克隆形成能力和FLPs形成数量也明显下降。4.下调ADAM22表达后胃癌耐药细胞中黏附相关分子FAK以及Paxillin的磷酸化水平受到了明显抑制。GST-pulldown联合Western blot结果表明干扰ADAM22表达后耐药细胞中Rho GTP酶Rac1和Cdc42的活性也明显下降。针对ITGB1活化表位HUTS4的Western blot结果显示,ADAM22表达下降后ITGB1的活性也随之下降。功能实验表明激活ITGB1可以逆转下调ADAM22对耐药细胞黏附和体内外侵袭迁移能力的抑制。免疫共沉淀结果表明ITGB1可以与野生型ADAM22相互作用,但不能与Disintegrin缺失的突变型ADAM22相互作用。野生型而非突变型ADAM22可以补救下调内源性ADAM22对胃癌耐药细胞黏附、迁移和3D克隆形成能力的抑制。5.在胃癌耐药细胞中下调ADAM22、Rac1或者Cdc42均可以显著降低SGC7901/ADR和SGC7901/VCR对多种化疗药物的IC50。q RT-PCR和Western blot结果显示在胃癌耐药细胞中下调ADAM22或者Rac1和Cdc42的表达可以显著降低HIF1α和ABCB1及其编码蛋白的表达。6.ADAM22在胃癌转移灶中的表达水平明显高于其相应的原发灶组织。相关性分析表明ADAM22在胃癌组织中的表达与HUTS4的表达呈正相关。Kaplan-Meier生存分析显示胃癌组织中ADAM22和HUTS4高表达与患者预后差相关。Cox多因素回归分析发现ADAM22或HUTS4高表达及肿瘤的N分期和患者年龄是患者预后不良的独立风险预测因子。【结论】本课题筛选并阐明了一条促进胃癌耐药细胞侵袭转移的信号通路:化疗药物诱导胃癌细胞高表达ADAM22,后者通过Disintegrin结构激活ITGB1增加肿瘤细胞对细胞外基质的黏附和内皮穿透能力,并赋予转移肿瘤细胞在转移灶微环境的克隆增殖优势,从而促进耐药细胞的侵袭转移。同时,该通路通过影响HIF1α和ABCB1及其编码蛋白的表达促进胃癌细胞的多药耐药。该研究加深了对胃癌细胞耐药和转移关系的认识,并为开发同时针对胃癌耐药和转移的治疗策略提供了靶点。