论文部分内容阅读
研究背景：脑内多药耐药基因1(multidrug resistance-1, mdrl)编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)等脑内药物转运体过表达,是耐药性癫痫(Drug-Resistant Epilepsy, DRE)发生的主要机制之一。新近研究发现,炎症反应可能是所有类型癫痫发生发展的一个共同的危险因素,癫痫相关炎症反应可诱导脑内P-gp过表达。高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box-1, HMGB1)是主要炎症激活因子,作用于模式识别受体如Toll样受体4(Toll Like Receptor4, TLR4)等介导免疫炎症反应,降低癫痫发作的阈值,加重癫痫发作,可能与DRE的形成有关。其他诸多非癫痫领域的研究已证实,TLR4激活是启动核转录因子-kappa B(nuclear factor-kappa B, NF-κB)经典活化信号通路的重要途径；而NF-κB活化是炎症反应的中心环节,参与了癫痫急、慢性炎症反应,且与P-gp过表达有关；动物实验已证实HMGB1可促使胃腺癌P-gp过表达,那么癫痫脑内高表达的HMGB1是否介导P-gp过表达,是否通过HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路调控癫痫脑内P-gp过表达,目前未见相关报道。第一部分HMGB1及其拮抗剂BoxA对癫痫大鼠海马P-糖蛋白表达的影响目的：探讨HMGB1及其拮抗剂BoxA对癫痫大鼠脑P-糖蛋白表达的影响。方法：将雄性SD大鼠随机分组为假手术组、癫痫组、低、中、高剂量HMGB1干预组,每组12只；低、中、高剂量BoxA干预组,每组6只。采用海马微量注射海人酸(kainic acid, KA,3μl,0.5μg/μl)制作癫痫大鼠模型,HMGB1干预组、BoxA干预组于注射KA前15min,分别侧脑室微量注射10μl不同剂量重组HMGB1(10、100、1000ng)蛋白或不同剂量BoxA (14、140、1400ng)进行干预。记录癫痫大鼠自注射KA后至初次达到Ⅲ级发作的时间(Seizure Onset Time, SOT),作为评价癫痫发作易感性指标；造模成功24h后处死大鼠,分别采用免疫组化法、实时定量荧光PCR和蛋白质免疫印迹法,检测并比较各组大鼠海马组织损伤、多药耐药基因1(multidrug resistance-1, mdr1) mRNA及其蛋白P-gp的表达。结果：与癫痫组比较：中、高剂量HMGB1干预组SOT缩短(P<0.05),海马组织结构紊乱,海马CA3区神经元过度丢失(P<0.05),海马mdr1a/b mRNA及P-gp表达增加(P<0.05)；而低剂量HMGB1干预组与癫痫组比较,以上各项指标差异则无统计学意义(P>0.05)。中、高剂量BoxA干预组与癫痫组比较,其mdr1a/b mRNA及P-gp表达水平低于癫痫组,差异均有统计学意义(P<0.05)；与癫痫组比较,低剂量BoxA干预组mdr1a mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),而mdr1b mRNA及P-gp表达虽下降,但差异则未显示统计学意义。结论：HMGB1可增加癫痫鼠发作易感性,加重海马组织损伤,促进海马组织P-gp过表达,其拮抗剂BoxA可抑制海马P-gp过表达,提示HMGB1可调控癫痫鼠脑P-gp表达。第二部分HMGB1/TLR4/NF-KB信号通路对癫痫小鼠海马P-gp表达的调控作用目的：探讨HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路对癫痫小鼠海马P-gp表达的调控作用。方法：1.建立急性癫痫小鼠模型,将雄性C57BL/6小鼠随机分组为假手术组、癫痫组、HMGB1干预组、BoxA干预组,每组12只；另用HMGB1干预野生型雄性小鼠、TLR4基因敲除型小鼠,每组6只。采用海马微量注射KA(0.5pl,0.014μg/μl)制作急性癫痫小鼠模型,HMGB1干预组、BoxA干预组于注射KA前15min,分别通过海马微量注射重组HMGB1(1μl,5.5μg/μl)或BoxA (1μl,2.5μg/μl)蛋白进行干预。干预24h后处死小鼠,分别采用免疫组化法和蛋白质免疫印迹法检测并比较各组大鼠海马组织损伤及HMGB1、TLR4、IκB激酶亚基β (IKKβ)、NFκB-p65亚基(p-65)、磷酸化NFκB-p65亚基(p-p-65)、P-gp等蛋白表达。2.建立慢性癫痫小鼠模型,将雄性C57BL/6小鼠随机分组为假手术组、癫痫组、HMGB1干预组、BoxA干预组,每组6只。采用海马微量注射KA(0.05μl,4μg/μl)制作慢性癫痫小鼠模型,造模成功14d后,HMGB1干预组、BoxA干预组分别通过海马微量注射重组HMGB1(1μl,5.5μg/μl)或BoxA (1μl,2.5μg/μl)蛋白进行干预。干预24h后处死小鼠,采用蛋白质免疫印迹法检测并比较各组大鼠海马组织p-p65、P-gp的表达。结果：1.在急性癫痫小鼠模型中,与癫痫组比较,HMGB1干预组海马CA1区组织结构紊乱,神经元过度丢失,P-gp染色阳性细胞计数百分比升高,差异均有统计学意义(P<0.05); BoxA干预组与癫痫组比较,CA1区组织结构紊乱,神经元过度丢失较轻,P-gp染色阳性细胞计数百分比下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。HMGB1干预组与癫痫组比较,HMGB1、TLR4、IKK β、p-65、p-p-65、P-gp等蛋白表达均增高,差异有统计学意义(P<0.05),而BoxA干预组与癫痫组相比,仅HMGB1、TLR4、p-p-65、P-gp等蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。TLR4基因敲除型小鼠与野生型小鼠比较,p-p-65、P-gp等蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。2.在慢性癫痫小鼠模型中,与癫痫组比较,HMGB1干预组p-p-65、P-gp表达均增高,差异有统计学意义(P<0.05)；与癫痫组比较,BoxA干预组p-p-65表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),虽其P-gp表达下降,但差异未显示统计学意义。结论：HMGB1可通过激活TLR4,诱导NF-κB信号通路促进癫痫小鼠脑P-gp过表达。