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猪博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)属于细小病毒科(Family)博卡病毒属(Genus)的新成员,目前其在猪群疾病中的作用机制还未见明确,主要是由于该病毒仍无法获得纯培养和动物回归实验。猪博卡病毒存在多种亚型:PBoV1、PBoV2、PBoV3、PBoV4和PBoV5,目前多国见有猪群感染博卡病毒的研究报道,有关福建样本的猪博卡病毒基因研究较少。为研究猪博卡病毒生物学信息,建立快速、有效的检测方法,研究内容如下:1、PBoV福建株(PBoV-FJ2014-01株)NS1基因的克隆与序列分析本研究在前期对腹泻猪群进行流行病学调查中获得一株猪博卡病毒阳性病料。为明确猪博卡病毒福建株非结构蛋白基因编码区1(NS1)的基因特点,本实验采用分段PCR扩增的办法,获得猪博卡病毒福建株的NS1基因全长。序列拼接结果表明,克隆得到的猪博卡病毒PBoV福建株(PBoV-FJ2014-01株)NS1基因的核苷酸长度为2 004 bp,编码667个氨基酸(amino acids,aa),在遗传进化上和其他猪博卡病毒5型处于同一遗传进化分支。PBoV福建株(PBoV-FJ2014-01 株)NS1 基因和 GenBank 中登陆的 PBoV5 代表株 5/JS677(GenBank登录号JN831651)核苷酸同源性最高,高达98.4%。和另一PBoV5代表株HB11(GenBank登录号JN621325)核苷酸同源性也较高,为96.0%。除PBoV3 代表株 IA270-2(GenBank 登录号 JN621325)、pig/ZJD/China/2006(GenBank登录号JN681175)外,与其他猪博卡病毒代表株PBoV3、PBoV4的核苷酸在80.0%～90.0%之间。此外,与我国较早报道的PBoV1代表株PBoV1 pig/ZJD/China/2006(GenBank 登录号 HM053693)和 PBoV2 代表株PBoV2pig/ZJD/China/2006(GenBank 登录号 HM053694)核苷酸同源性较低,分别为52.5%和53.2%,推导出福建源猪博卡病毒为猪博卡病毒5型。2、PBoV5实时荧光定量PCR方法的临床应用本研究建立基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PBoV5方法,经过条件优化后建立可用于对PBoV5的临床检测,并采集了粪便(主要是肠道内容物)样品74份、血液样品142份和仔猪脏器样品91份进行PBoV5的流行病学调查。结果表明,本研究建立检测PBoV5的方法线性关系好、扩增效率高,变异系数小(组内变异系数和组间变异系数),分别为0.35%～1.24%和0.43%～1.46%。建立检测PBoV5的方法特异性强,仅对PBoV5出现特异性检测信号。临床检测结果表明,74份粪便(主要是肠道内容物)样品检测到7份阳性样品,阳性率为9.46%;142份血液样品检测到6份阳性样品,阳性率为4.23%;91份仔猪脏器样品检测到11份阳性样品,阳性率为12.09%。综上,本研究克隆获得了 PBoV5福建株(PBoV-FJ2014-01株)NS1基因全长,并对其进行了生物信息学分析。同时,建立了基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PBoV5方法,可用于对临床样品的分子流行病学调查。