背景:急性心肌梗死(AMI)后心室重构(ventricular remodeling)指心肌梗死后心室的大小、结构以及心脏功能的变化过程,主要包括心肌梗死区膨出,非梗死区心肌肥大、室壁增厚、心肌间质纤维化,最终导致整个心室进行性扩张、心脏收缩功能减低,它已成为心肌梗死患者晚期死亡的主要原因。骨髓干细胞移植可改善心功能、预防心室重构,但其机制尚不完全清楚,可能与以下途径有关:抑制心肌重构,阻止心肌细胞肥大和重构;抑制基质重构,减少胶原沉积和纤维化;促进血管重构,促进毛细血管新生和原有血管系统增殖,减少心肌细胞凋亡。目前,成体干细胞成为心脏细胞移植的主要细胞源,常用于移植的成体骨髓干细胞有骨髓BM-MNC(BM-MNC)、骨髓MSCs(BMSCs)和内皮祖细胞(EPCs)等。目的:对比研究自体BM-MNC、MSCs对AMI后心室重构的影响,探讨不同干细胞移植对心室重构影响的机理。评价经冠状动脉BM-MNC和MSCs移植治疗AMI的效果及其安全性,为临床防治AMI后心室重构、治疗心力衰竭提供安全、有效的方法。方法:本研究以小型猪为研究对象,随机分为对照组(假手术组)、单纯AMI模型组、BM-MNC移植组、MSCs移植组。1.通过穿刺股动脉或颈总动脉,用球囊导管压迫冠状动脉前降支的方法,建立小型猪急性心肌梗死动物模型。2.采用密度梯度离心法分离BM-MNC,采用贴壁法分离、培养MSCs,利用胶体金进行细胞标记。3.在急性心肌梗死90min时,进行经冠状动脉腔内自体BM-MNC和MSCs移植。4.心功能评价:分别于术前、术后即刻、干细胞移植后28天进行超声心动图检查,观察心功能情况。5.光、电镜病理学及免疫组化检查:单纯AMI组及BM-MNC和MSCs组,分别于造模后及干细胞移植后28天,进行心肌微血管计数、光镜、透射电镜检查、心肌组织核因子кB、心肌细胞凋亡检测、心肌增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen PCNA)免疫组化检测。6.采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法,于AMI后28天检测心肌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的mRNA表达。结果:1.小型猪急性心肌梗死后心力衰竭模型的建立:36只猪均完成了PTCA球囊封堵术,28天后有31只成活。其中对照组存活6只、心肌梗死模型组及MSCs组各存活8只、BM-MNC组存活9只。球囊堵闭LAD2h ST段抬高的幅度为(0.43士0.35mv)。用球囊堵闭LAD后24h对照组、模型组、单个核组、间充质组CK水平分别为(112.50±70.23;1190.50±734.05;1162.55±837.23;1142.00±308.90 F=4.80,P=0.008);CK-MB水平分别为(15.33±5.85;121.62±74.11;101.77±79.65;105.25±42.42 F=3.93,P=0.019);cTnI水平分别为(2.48±1.13;49.66±44.73;55.05±47.42;45.61±26.73 F=2.78,P= 0.06)。单纯AMI模型组、单个核组、间充质组比对照组血清心肌损伤标志物cTnI和CK、CK-MB水平均升高,差别有显著性意义。单纯AMI模型组、BM-MNC和MSCs之间心肌损伤标志物水平无显著差异。通过心脏超声检查发现术前各组的左室收缩末内径(ESD)、左室舒张末内径(EDD)、左室射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)均无显著性差异。术后2h时,正常对照组、AMI模型组、BM-MNC和MSCs组EF分别为(61.70士3.91%;46.2士23.62%;45.13士33.02;47.25士5.41 F=23.88 P=0.0001),AMI模型组、BM-MNC和MSCs组的EF值比正常对照组降低,差别有显著性意义。AMI模型组、单个核组、间充质组的组间EF值差异无统计学意义。术后28天光镜检查发现,模型组的梗死区可见大片纤维化区,梗死区及边缘区可见大量炎性细胞浸润,干细胞移植组的梗死纤维化区及梗死边缘区可见大量血管增生、炎细胞浸润。电镜下梗死模型组、BM-MNC和MSCs组的心肌梗死区可见大量纤维母细胞增生。2.骨髓BM-MNC和MSCs体外分离、培养、诱导分化和鉴定。骨髓细胞经密度梯度离心后,可清楚观察到介于分离液和血浆间的BM-MNC层。通过贴壁法获得MSCs,72h可见细胞分散贴壁生长,2-4天后细胞开始快速增殖,集落逐渐增大,9-11天细胞集落间出现相互融合,大部分呈长梭形,胞核较大,可见处于分裂期的核仁,胞体肥大,胞质丰富。集落达到80%-90%融合时进行消化传代,每瓶单层汇合的MSCs用胰蛋白酶消化后平均获得5.5×105个MSCs,将这些细胞再传代培养7天左右开始汇合,继续传代扩增。第10代以后的细胞增长速度明显减慢。3.经冠脉移植自体BM-MNC和MSCs对急性心肌梗死后心室重构的影响。心脏功能的变化:术后28天,正常对照组、BM-MNC组、MSCs组EDD均明显低于模型组(F=5.30,P=0.005),EF及FS均明显高于模型组(F=10.67,P=0.0001;F=6.64,P=0.0017)。正常对照组、BM-MNC组、MSCs组组间相比上述指标无显著性差异。正常对照组、模型组、BM-MNC组、间充质干胞组室壁运动异常指数依次为(1;3.25±1.03;2.44±0.72;2.25±0.46 F=11.95,P=0.001),模型组与BM-MNC和MSCs组相比有显著性差异。BM-MNC和MSCs组运动异常指数相比无显著性差异。28天时处死动物,光镜下可见BM-MNC移植组:在梗死纤维化区及梗死边缘区可见大量血管增生,梗死边缘区可见有大量炎细胞浸润。电镜下BM-MNC组,可见较多的毛细血管“芽生”现象。MSCs移植组在梗死边缘区可见不成熟的心肌细胞,胞核较小,可见胶体金颗粒。梗死模型组、BM-MNC组、MSCs移植组,在心肌梗死区、梗死边缘区及正常区均可见心肌细胞凋亡。血管数的变化:梗死区及梗死边缘区的血管数:梗死组、BM-MNC组、MSCs组比正常组的血管数增加,有非常显著性差异;BM-MNC移植组血管数比梗死组及MSCs组增加,有非常显著性差异(梗死区F=34.87 P=0.0001,边缘区F=29.56 P=0.0001);无梗死的正常心肌区:梗死组、BM-MNC组及MSCs组比正常组的血管数增加,有非常显著性差异;BM-MNC移植组及间充质组血管数比梗死组增加,有非常显著性差异(F=14.74 P=0.0001)。心肌组织核因子кB阳性率的变化:正常对照组与模型组、BM-MNC组、MSCs组的心肌梗死区的NF-кB阳性率无显著差异(F=1.02,P=0.397);与正常组相比模型组、BM-MNC组、MSCs组的心肌梗死边缘区的NF-кB阳性率均显著增加(F=19.05,P=0.001);BM-MNC组及MSCs组NF-кB阳性率比单纯AMI模型组显著降低;BM-MNC组、MSCs组间NF-кB阳性率无显著性差别;模型组、BM-MNC组、MSCs组的正常区NF-кB阳性率比正常组NF-кB阳性率显著升高(F=8.67,P=0.003);模型组、BM-MNC组、MSCs组之间的正常区NF-кB阳性率差异无显著性意义。心肌细胞凋亡检测结果:梗死区心肌细胞凋亡:模型组、BM-MNC组、MSCs组的梗死区心肌细胞凋亡率比正常组的增加,差别有非常显著性意义(F=14.31,P=0.0001),模型组、BM-MNC组、MSCs组间心肌细胞凋亡率差别无显著性意义。梗死边缘区心肌细胞凋亡情况:模型组、BM-MNC组、MSCs组心肌细胞凋亡率比正常组的增加,差别有非常显著性意义(F=35.34,P=0.0001);模型组比BM-MNC组及MSCs组心肌细胞凋亡率增加,差别有非常显著性意义,BM-MNC组及MSCs组之间心肌细胞凋亡率差别无显著性意义。正常区心肌细胞凋亡情况:模型组、BM-MNC组心肌细胞凋亡率比正常组的增加,差别有非常显著性意义(F=5.33,P=0.0052);MSCs组与正常组相比细胞凋亡率差别无显著性意义。心肌组织肌钙蛋白I及核增殖抗原(PCNA)免疫组织化学检测结果:心肌梗死区肌钙蛋白I表达减少,BM-MNC组以及MSCs组在梗死区及梗死边缘区,肌钙蛋白I表达增加。在梗死区冠状动脉周围可见肌钙蛋白I阳性表达。BM-MNC组以及MSCs组在梗死区及梗死边缘区可见大量PCNA阳性细胞生长。VEGF基因相对表达量:梗死模型组、BM-MNC组以及MSCs组的梗死区及梗死边缘区的VEGF基因表达量与正常对照组的相比增加,差异有非常显著性意义(梗死区F=20.11,P=0.0001;梗死边缘区F=49.41,P=0.0001); BM-MNC组梗死边缘区VEGF基因表达量比梗死模型组及MSCs组的升高有显著性意义;MSCs组与梗死模型组相比VEGF基因表达无显著差异。梗死模型组、BM-MNC移植组以及MSCs移植组的正常区的VEGF基因表达量与正常对照组的相比提高,差异有显著性意义(F=9.37,P=0.0002)。bFGF基因相对表达量:BM-MNC及MSCs移植组,心肌梗死区的bFGF基因表达量比梗死模型组及正常对照组均显著增加,差别有非常显著性意义(F=23.69,P=0.0001);BM-MNC及MSCs移植组之间,梗死模型组及正常对照组间bFGF无显著差异。MSCs移植组,心肌梗死边缘区的bFGF基因表达量比梗死模型组、BM-MNC组及正常对照组的均显著增加,差别有非常显著性意义(F=4.71,P=0.0091)。BM-MNC及MSCs移植组,正常区的bFGF基因表达量比正常对照组增加,差别有非常显著性意义(F=7.02,P=0.0013);梗死模型组与正常对照组相比,差别无显著性意义;MSCs移植组与梗死模型组相比差别有显著性意义。心功能与心肌细胞凋亡、心肌组织NF-кB、心肌血管数及VEGF、bFGF的相关性:AMI 28天时,LVEF与心肌细胞凋亡呈负相关(r=-0.4411,P=0.0273),与心肌NF-кB负相关(r=-0.5796,P=0.0006)。BM-MNC移植后28天,LVEF与梗死区、边缘区血管数正相关(r=0.775 , P=0.0003);与VEGF表达正相关(r=0.5651,P=0.0181);与bFGF表达正相关(r=0.5735, P=0.0161)。MSCs移植后,LVEF与心肌血管数正相关,(r=0.5437 , P=0.0295);与bFGF表达正相关(r=0.5857, P=0.0171);心肌细胞凋亡与心肌组织NF-кB呈正相关(r=0.7027,P=0.0001),。结论:1.采用球囊封堵的方法成功建立了心肌梗死后心力衰竭的动物模型。2.采用密度梯度离心法及贴壁法成功获得骨髓BM-MNC及MSCs,采用胶体金标记,减少了标记物对细胞的毒性作用。3.经冠脉自体BM-MNC及MSCs移植均可减轻心肌梗死后左心室重构,改善急性心肌梗死后心功能,可显著降低心肌梗死边缘区NF-кB表达,减轻梗死边缘区及正常区心肌细胞凋亡。BM-MNC及MSCs移植可显著增加梗死区、梗死边缘区及正常区血管数量;增加梗死区及梗死边缘区VEGF及bFGF表达。BM-MNC及MSCs移植后,移植细胞可在梗死部位心肌内存活。4.心功能的改善与干细胞移植后增加心肌血管数量、增加心肌VEGF及bFGF表达、减少心肌细胞凋亡以及减少心肌组织NF-кB水平有关。5. BM-MNC移植组促心肌血管增生作用优于MSCs组,BM-MNC移植组梗死边缘区心肌VEGF的表达优于MSCs组。MSCs移植后bFGF基因表达量比BM-MNC组显著增加。MSCs移植组胶体金标记细胞术BM-MNC组。