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第一部分mi R-221/222作用于PTEN发挥对PI3K/AKT/m TOR信号通路的调控作用目的:研究mi R-221/222在不同人多发性骨髓瘤(MM)细胞系内的表达情况及其靶向作用于PTEN,从而发挥对PI3K/AKT/m TOR信号通路的调节作用。方法:采用q RT-PCR法检测人MM细胞系NCI-H929、U266、OPM-2、MM.1S、MM.1R、RPMI8226、ARH-77等多个细胞系mi R-221/222的表达情况;设计合成mi R-221/222特异性模拟物mi R-221/222 mimics和特异性抑制物mi R-221/222 inhibitor,对mi R221/222低表达细胞系(MM.1S)以及高表达细胞系(OPM-2等)分别转染mi R-221/222 mimics/inhibitor,实验设置阴性对照转染组、正常对照组、mi R-221/222 mimics/inhibitor转染组;q RT-PCR法检测转染后mi R-221/222表达量;PI3K活性定量检测法检测PI3K活性变化;Western blot检测AKT、m TOR及p-AKT和p-m TOR蛋白的表达。结果:(1)mi R-221/222在OPM-2细胞系中高表达,MM.1S细胞系中低表达;(2)mi R-221/222 mimics能在不影响其它非编码小RNA表达的情况下有效的上调mi R-221/222在细胞系MM.1S中的表达量;mi R-221/222 inhibitor则能有效的下调mi R-221/222在MM.1R和OPM-2细胞系中的表达量;(3)上调mi R-221/222后,PI3K活性、p-AKT和p-m TOR蛋白表达量明显上调,总AKT和m TOR的表达量未见明显变化;(4)相反,下调mi R-221/222的表达量后,PI3K活性及p-AKT和p-m TOR表达明显下调,总AKT和m TOR表达无明显变化。结论:异常过表达的mi R-221/222可通过靶向作用于PTEN基因从而上调PI3K活性,进而使下游AKT和m TOR的磷酸化水平上调,通过拮抗该异常表达的mi R-221/222可降低PI3K/AKT/m TOR信号通路的磷酸化水平。第二部分mi R-221/222靶向作用于PTEN发挥对PI3K/AKT/m TOR信号通路调控及其多发性骨髓瘤细胞的凋亡与周期影响目的:利用表达/拮抗试验观察在人MM细胞系中不同mi R-221/222表达情况对MM细胞凋亡及周期的影响,并进一步探讨其机制。方法:设计合成mi R-221/222特异性模拟物mi R-221/222 mimics和特异性抑制物mi R-221/222 inhibitor,用mi R-221/222 mimics转染MM.1S使其mi R-221/222的表达水平上调,以及mi R-221/222 inhibitor转染MM.1R使其mi R-221/222表达水平下调,实验设置阴性对照转染组、正常对照组、mi R-221/222 mimics/inhibitor转染组,转染24小时后给予药物(雷帕霉素);q RT-PCR法检测转染后mi R-221/222表达量;PI3K活性定量检测法检测PI3K活性变化情况;Western blot检测mi R-221/222表达量对AKT、m TOR等信号通路蛋白表达水平的影响;利用CCK-8检测mi R-221/222表达量对MM细胞系的增殖影响;采用Annexin V FITC/PI双染法流式细胞仪检测mi R-221/222过表达或抑制对MM细胞凋亡的影响;采用碘化丙啶(PI)单染法流式细胞仪检测mi R-221/222过表达量对MM细胞周期的影响。结果:(1)下调mi R-221/222的表达可以明显抑制MM.1R细胞增殖能力,能诱导MM细胞凋亡,并促其向S期转变;(2)上调mi R-221/222的表达后能促进MM.1S细胞的增殖,减少其凋亡,并诱导其向G0/G1期转变;(3)下调mi R-221/222联合PI3K/AKT/m TOR通道抑制剂(雷帕霉素)作用于MM细胞系可以更有效地抑制肿瘤细胞的增殖,并且能够减低药物的IC50;(4)雷帕霉素不仅可以作为m TOR的抑制剂,同时也可以抑制PI3K的活性,从而诱导MM细胞凋亡;结论:沉默mi R-221/222的表达能够抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路的激活,使其磷酸化水平降低,从而抑制骨髓瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡以及阻滞细胞周期,最终抑制骨髓瘤细胞的生长;此外,下调mi R-221/222表达水平能减低抗MM药物的IC50,从而避免大剂量化疗药的相关毒副作用。