背景资料:大肠癌(Colorectal cancer,CRC),主要包括结肠癌和直肠癌,或称结直肠癌,是发病率以及死亡率非常高的恶性肿瘤之一。大肠癌是世界上第三种常见的癌症,同时也是全球第四大癌症死亡原因,每年造成约60万人死亡。并且该癌症的患病率有逐年递增的趋势,据统计,于2008年全球就有120万新增病例。大肠癌是一个多基因、多阶段以及长期形成的病变过程。早期发现、诊断以及治疗对于提高大肠癌的治愈率是非常重要的。但大肠癌的发病原因大多比较隐匿,多数患者的症状并不明显,往往发病己经到了中晚期。大肠癌的危险因素是多重的,包括大肠癌的家族史,久坐,腰围增粗,便秘,过多的摄入红肉、油炸、烟熏、腌晒及盐渍食品以及药物等。大肠癌的发病率和年龄有很大的关系,低于50岁的人群呈现低的发病率,而高于50岁的老年人有着较高的发病率。累积的证据表明处于低收入水平的国家和人群,大肠癌的发生率和死亡率均快速增加。尽管大肠癌患者的预后正在随着科技的进步而缓慢地改善,但是在低收入国家,大肠癌患者的5年相对生存率仍然低于50%。因此,迫切需要探索针对大肠癌治疗的新颖且有效的治疗靶点。近年来,微小RNA(micro RNA,mi RNA)因其在调控目的基因表达方面的重要作用,成为了癌症治疗领域所关注的焦点。mi RNA是一类单链的非编码的RNA分子,长度大约为22个核苷酸。mi RNA广泛存在于真核生物中,在多种生理活动中起到了重要的调节功能。mi RNA可以通过与其互补的m RNA的3’UTR(3’-untranslated region)区域进行碱基互补配对,来调控基因的表达进而发挥相应的生物学功能。研究表明,mi RNAs广泛存在于各个物种和组织中,并参与调节细胞生长发育、分化、凋亡,并能影响肿瘤的生长。一些研究证实mi RNA可作为抑癌基因或致癌基因直接参与人类肿瘤(如肺癌、肝癌及乳腺癌等)的形成,是肿瘤发生和发展过程中的重要分子。研究表明,在大肠癌中差异表达的mi RNA均可通过作用于肿瘤相关的靶基因来调控肿瘤的发生和发展。然而,对于其中绝大部分mi RNA,它们作用的靶基因以及具体的生物学功能目前仍有待于进一步研究。组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)是一类蛋白酶,帮助乙酰基(O=C-CH3)从组蛋白中分离出来,使得组蛋白能够更加严密的包裹DNA。HDAC在调控基因表达和对染色体修饰方面发挥了重要的作用。通常情况下,HDAC会使染色质集缩,抑制基因的表达,这其中当然也包括肿瘤的抑制基因。HDAC共有I,II,III,IV四类。HDAC2属于I类HDAC,是一种关键的疾病调节因子。在胃癌、大肠癌、前列腺癌中HDAC2的高表达与癌症的预后不良相关。有证据表明,一些mi RNA可以通过调控HDAC2来实现抗癌或是抑癌作用。因此,研究能与HDAC2靶向的mi RNA,有利于我们了解HDAC2在大肠癌发病机制中的作用,为大肠癌的基因治疗提供理论支持。目的:本文通过以下研究揭示HDAC2和mi R-455对于大肠癌细胞生长的作用,以及HDAC2和mi R-455之间的靶向关系。研究HDAC2在大肠癌组织和癌旁组织中的表达差异。其后,在人大肠癌细胞系HCT116中敲低表达HDAC2,研究HDAC2沉默对大肠癌细胞的增殖影响。同时研究HDAC2和mi R-455之间的靶向关系,检测mi R-455过表达对于细胞的增殖和凋亡影响。最终揭示了mi R-455可抑制HDAC2对大肠癌的致癌作用。方法:收集2014年3月~12月20例来自青岛大学附属医院的大肠癌手术标本。收集癌组织及癌旁组织迅速置于液氮中,于-80°C保存。该20名大肠癌患者术前未接受化疗或放疗。应用荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)方法检测20例大肠癌组织及对应的癌旁组织中HDAC2的表达水平,比较两组织中HDAC2的表达是否有显著性差异。选取人大肠癌细胞系HCT116进行细胞培养。将含HDAC2基因的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA,sh RNA)构建到慢病毒GV118中,并将该慢病毒转染到HCT116细胞中,对细胞中HDAC2基因表达进行沉默。通过q RT-PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测转染后细胞中HDAC2基因和蛋白表达变化,以确定转染效率。其后,用MTT比色法分别检测转染后1~5天,5个时间段的细胞增殖改变情况。应用Target Scan和microrna靶基因搜索数据库预测HDAC2和mi R-455之间的靶向序列。将推测的HDAC2上可以与mi R-455靶向的序列插入到pmir GLO载体中,并将该载体与mi R-455模拟剂(mi R-455 mimics)一同转染到细胞中。转染后48 h,用双荧光素酶报告基因分析系统检测荧光素酶活性,以判断HDAC2和mi R-455是否存在靶向关系。除此之外,mi R-455 mimics转染细胞后,q RT-PCR和Western blot方法检测细胞中HDAC2的基因和蛋白表达变化,检测HDAC2和mi R-455的表达调控关系。HCT116细胞转染mi R-455 mimics后,用MTT比色法分别检测转染后1~5天,5个时间段的细胞增殖改变情况。应用流式细胞计数检测转染后HCT116细胞凋亡情况,比较mi R-455转染细胞和未转染细胞之间的显著性差异。结果:HDAC2在大肠癌中的表达及其对大肠癌细胞的增殖影响:HDAC2在20例大肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织中的表达(P<0.05)。在人大肠癌细胞系HCT116中转染HDAC2 sh RNA慢病毒,q RT-PCR和Western blot检测结果表明相较于转染sh RNA控制组,HDAC2在HDAC2 sh RNA慢病毒转染的细胞中被显著敲低(P<0.001),说明HDAC2在大肠癌细胞中被成功沉默。MTT比色法结果表明,转染HDAC2 sh RNA慢病毒3、4以及5天后,细胞增殖显著下降(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。HDAC2和mi R-455之间的靶向关系:Target Scan和microrna靶基因搜索数据库预测HDAC2的3’UTR上能与mi R-455直接结合的序列为UGGACUG。将该靶向序列插入到pmir GLO载体中,并将该载体与mi R-455 mimics(mi R-455模拟物)一同转染到细胞中。结果显示,荧光素酶活性显著下降(P<0.01)。q RT-PCR和Western blot检测结果表明,HDAC2基因和蛋白在mi R-455 mimics转染的细胞中低表达(P<0.01)。表明HDAC2的表达可被mi R-455下调。miR-455对大肠癌细胞的增殖和凋亡影响:MTT比色法结果表明,转染mi R-455 mimics 3、4以及5天后,细胞增殖显著下降(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。流式细胞仪检测结果表明,转染mi R-455 mimics后,凋亡细胞比例显著提高(P<0.001)。结论:1.HDAC2基因在大肠癌组织中高表达,提示HDAC2可能参与了大肠癌的发生和发展;2.HDAC2沉默降低了人大肠癌细胞系HCT116的细胞增殖,提示HDAC2在大肠癌中具有促癌作用;3.HDAC2是mi R-455的靶基因,并且HDAC2可被mi R-455下调;4.mi R-455过表达抑制HCT116细胞增殖,促进HCT116细胞凋亡,提示与HDAC2相反,mi R-455具有抑制大肠癌的作用;5.mi R-455可以抑制HDAC2对大肠癌的致癌作用。