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目的:miRNA是一类小分子非编码RNA,具有转录后水平调控基因表达的功能。该分子广泛参与生长、发育和疾病发生等过程。目前,miRNA的研究难点是其靶基因的发现。生物信息学方法虽然预测了大量的miRNA的靶基因及其位点,但是只有少部分获得实验数据支持。因此在预测结果基础上,运用基因芯片对部分miRNA进行了进一步筛选,为下一步验证工作提供候选研究对象。
方法:运用基因芯片技术,比较了HepG2和HepG2.2.15细胞的miRNA和mRNA表达谱,并对两种细胞中表达差异显著的miRNA,在TargetScan和PicTar数据库中搜集了预测的miRNA靶基因。由于miRNA在某些情况下能够降解mRNA,对miRNA的靶位点进行进一步筛选可以借助于两种细胞的mRNA表达谱中显示的差异表达基因。初步筛选获得的miRNA与靶基因,主要通过萤光素酶报告基因方法、细胞内过表达或反义抑制miRNA,检测靶基因的表达等实验进行验证。
结果:
1、本研究在HepG2和H印G2.2.15细胞中发现23个表达差异显著的miRNA以及大量差异表达基因。运用生物信息学和基因芯片数据对miRNA的靶基因进行了筛选。
2、完成表达miR-195的重组腺病毒构建,并找出了miR-195在细胞周期调控中调控的靶基因:CCNDI和CDK6。
3、运用反向预测方法,发现了能够调控DUSP1的三种miRNA:miR-101、miR-133、miR-144。实验表明,这三种miRNA在细胞应激中对MAPK信号转导通路具有调控功能。
结论:
1、在生物信息数据库数据分析基础上,运用基因芯片方法,对23种miRNA的靶基因进行了初步筛选,为后续验证工作提供研究对象。
2、对miR-195、miR101、miR-133、miR-144的功能进行了初步研究,获得了上述miRNA的靶基因。