猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染引起的一种严重的急性、接触性肠道传染性疾病,该疾病主要以感染猪群出现腹泻、呕吐、脱水等严重的肠炎为特征,具有较高的传染性和死亡率。自1971年PEDV在英国被首次报道以来,PEDV多次爆发,已蔓延至世界许多国家和地区,给世界养猪行业造成了巨大的经济损失。对于PEDV在机体内外的感染机制,国内外的许多学者已经做了大量研究。据相关文献报道,病毒的某些蛋白可以有效地抑制或促进PEDV在体内外的复制和增殖,并且有些病毒非结构蛋白对PEDV复制机制影响与NF-κB信号通路的激活有关。NF-κB是细胞内重要的核转录因子,参与机体的炎症反应、免疫应答等过程。为了了解广东省PEDV遗传变异情况,试验采用RT-PCR方法对2018-2019年采集到的来自广东省74份样品进行PEDV抗原检测,并将部分阳性样品的S1、M和ORF3基因序列进行测序,将测序结果与参考毒株进行进化树构建、同源性分析以及氨基酸序列比对。经RT-PCR法检测共有38份样品为PEDV阳性,阳性率为51.35%,阳性率较高。在PEDV S1遗传进化分析中,检测毒株均位于G2分支,与VN-VAP1113核苷酸同源性较高,为96.0%～97.6%,主要有3个氨基酸缺失和5个氨基酸插入,以及多个氨基酸突变。在PEDV M遗传进化分析中,GDxh株位于G1分支,与DR13核苷酸同源性较高,为98.3%,GDhz毒株位于G2-1分支,与VN-VAP1113的核苷酸同源性较高,为98.3%,其他12个检测毒株位于G2-2分支,与OH851核苷酸同源性较高,为97.4%～99.1%,主要有5个氨基酸突变。在PEDV ORF3遗传进化分析中,GDxh株与DR13核苷酸同源性为91.6%,主要有4个氨基酸突变和一段氨基酸缺失,其他检测毒株均位于G2分支,与OH851、VN-VAP1113核苷酸同源性较高,分别为82.7%～92.0%、83.1%～87.6%,其中8株主要有5个氨基酸突变,另外5株主要有11个氨基酸突变。本研究通过qPCR、TCID50检测以及Western blot的方法对PEDV非结构蛋白nsp6、nsp7、nsp8、nsp9和nsp10进行了初步研究,研究发现Vero E6细胞感染PEDV后12 h、24 h和36 h,这几个PEDV非结构蛋白能够促进PEDV在细胞内复制和增殖。双荧光素酶报告基因检测试验发现PEDV nsp9在293T细胞中明显抑制NF-κB信号通路。进一步研究发现PEDV nsp9可以明显抑制细胞内CCL2、IFNα、IFNβ以及TNFα的表达,并且逐渐降低细胞因子IL8的表达量,PEDV nsp9可以抑制P65和IKBα的磷酸化。本研究发现广东省PEDV流行毒株主要是G1和G2型毒株,S1和ORF3基因片段存在多个氨基酸突变位点,比较不稳定,M基因较为保守。研究发现PEDV非结构蛋白nsp6、nsp7、nsp8、nsp9和nsp10具有促进PEDV复制的功能。PEDV nsp9可能通过抑制P65、IKBα磷酸化及IKBα降解来抑制NF-κB信号通路的激活,抑制细胞因子IL8、CCL2、IFNα、IFNβ以及TNFα的表达,从而促进PEDV在细胞内的复制过程。这些结果为广东省PEDV疫情防控以及进一步阐明PEDV在细胞内复制的机制提供了理论基础。