研究背景及目的杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是一种由于肌营养不良蛋白(dystrophin)的缺失而造成的严重的神经肌肉疾病。肌营养不良蛋白由位于X染色体上的DMD基因编码,当DMD基因发生无义或移码突变时,则导致肌营养不良蛋白在细胞内翻译发生缺陷,生成截断的无功能的蛋白异构体。DMD是伴X染色体隐形遗传病,在男婴中的发病率约为1/3500。DMD患者遭受进行性和不可逆的肌肉损伤和萎缩,最终导致患者在20-30岁时死亡,至今没有有效的药物。因此研发一种新的治疗DMD的药物就极为重要。RNA剪接是真核生物基因表达转录后加工中的重要一环,此过程发生异常会导致很多疾病的发生。近年来,反义核酸技术被证明可以纠正基因的剪接错误从而达到治疗人类疾病的目的,比如诺西那生(nusinersen)能有效地纠正SMN2基因的剪接错误、增加其外显子7的列入从而治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)。反义核酸技术也可以被用来促进外显子的跳跃从而纠正由基因突变引起的阅读框移位。DMD基因是人类最大的基因之一,包含有79个外显子,外显子43-53这一大段区域为发生突变的热点区域,通常会导致原有开放阅读框被破坏,蛋白翻译提前终止。针对这类突变的药物研发策略之一是采用反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)促进外显子51的跳跃从而恢复阅读框。新产生的肌营养不良蛋白尽管丢失了几个外显子但最终产物保留了绝大部分氨基酸序列,因此该蛋白保存了基本的生物功能,患者症状将达到极大改善。据统计,这一方法可以适用于约13%的DMD患者。国际上已有一个ASO药物(eteplirsen)可通过促进外显子51跳跃而治疗DMD患者,但其效果非常有限,特别是至今未有蛋白证据证明其治疗效果。本项目旨在设计和筛选以外显子51跳跃为靶点的新一代具有极高药效的ASO药物。方法利用SLIC方法,以pCI-neo质粒为载体,构建DMD minigene pCI-DMD51;利用定点突变技术探索外显子51和两侧内含子上的潜在剪接调控序列;在SMN1 minigene载体pCI-SMN1上分析常见剪接抑制序列的作用特征;设计大量靶向内含子50、外显子51和内含子51的ASO序列,并进行初步筛选(initial walk)和围绕潜在靶点序列的优化筛选(micro walk);进一步设计和筛选双功能ASO以增强其诱导外显子51跳跃的效果;探索候选ASO的剂量效应;部分二代ASO在人骨骼肌细胞内源基因进行了效果测试。所有质粒和ASO皆用Lipo2000转入HEK293细胞或人骨骼肌细胞,采用荧光标记半定量RT-PCR检测minigene外显子的剪接变化。结果DMD minigene成功构建后,首先针对外显子51进行一系列的删除突变,没有观察到任何突变体出现外显子51剪接的变化,推断该外显子上不存在较强的剪接调控元件,这一结果印证DMD的外显子51并非盒式可变剪接外显子。接着设计和筛选了大量针对外显子51和其两侧内含子序列的ASO,发现数个ASO对外显子51的剪接具有明显抑制作用,效果优于eteplirsen,其机制值得进一步研究。我们针对3个初筛ASO在其靶点附近进行细筛优化,发现其中一个ASO(编号022012)能在较低浓度(10 nM)显著抑制外显子51剪接。为了进一步提高ASO的效果,我们尝试研发了二代双功能ASO,即在022012的一侧或两侧附加一个剪接抑制序列。通过对多种剪接抑制序列的摸索,发现TAGGGTTAGGG这一序列效果最明显,因此可作为设计二代ASO的潜在序列;在细胞检测中发现一个二代ASO(编号SG0236)的抑制剪接效果最佳,剂量效应分析显示在1nM时就具有明显效果,使外显子51列入百分比降至50%以下,而10 nM时,列入百分比降至1%;将部分PMO修饰的二代ASO转染至入骨骼肌细胞后,发现SG0236能降低内源DMD基因外显子51列入,效果明显强于上市药物eteplirsen。以上结果为以后的体内实验奠定了基础。结论促进DMD外显子51跳跃的反义核酸技术可以用于治疗约13%的DMD患者,通过在HEK293细胞中进行大量ASO的靶向筛选,我们得到了若干个可以促进外显子51跳跃的ASO。通过进一步筛选和设计二代ASO,我们鉴定出一个ASO候选药物,SG0236,在极低浓度下,能在HEK293细胞中显著促进外显子51跳跃,并在疾病相关细胞观察到明显好于上市药物eteplirsen的效果。该ASO候选药物具有治疗DMD的潜力,进一步的动物试验在进行之中。