1.研究背景中医“同证异病”的理论,提示了中医证候的综合性临床表征与西医的疾病可能存在着相关性。但是中医临床诊断和证候类中药的使用,不能完全套用西医的标准,所以研究出具有中医特色的临床诊疗方法尤其重要。因此以中医证候为基础的临床研究如雨后春笋般快速发展。但目前证候类研究多以传统临床疗效评价为主,而有关新技术和多学科结合型研究较少。本研究在“同证异病”理论指导下,拟利用网络药理学、分子生物学等相关学科的技术,以气虚血瘀证为例,比较证候代表性症状组与相关疾病的基因网络,提出基于功能模块网络富集分析的研究方法,深入研究证候与疾病、疾病与疾病之间的相关性,并初步探索针对气虚血瘀证基因网络的中药组方,为证候类中药的临床使用和研发提供新的思路。2.研究目的本研究以中医常见证候气虚血瘀证为例,通过构建气虚血瘀证涉及的症状组与相关疾病的基因整合网络,识别功能模块并富集相关的生物学功能和信号通路,以揭示中医“同证异病”理论下证病结合的相关生物学机制,同时,结合文献在基因水平上寻找气虚血瘀证相关疾病临床中药组方的新规律,为证候类新药研发提供新的依据。3.材料与方法3.1气虚血瘀证证候与疾病相关数据的来源本研究根据王永炎院士的经验方益气通络胶囊对“气虚血瘀”证候的“心、脑、肾”病变作用,检索中国期刊全文数据库(CNKI)和万方电子数据库中关于气虚血瘀证的临床性研究文献,确定气虚血瘀证证候的代表性症状组和相关疾病。利用OMIM数据库查找气虚血瘀证代表性症状组和疾病的相关基因。3.2基因网络的构建运用安捷伦文献检索软件构建气虚血瘀证证候与相关疾病重叠和独有的相关基因网络,并用Cytoscape软件对数据进行了可视化网络处理,分析基因网络的拓扑属性,包括聚类系数、节点数、网络直径、网络中心性、网络半径等。3.3功能模块的识别分别对重叠基因和各自独有基因网络,运用MCODE的聚类分析方法进行模块的识别并分析它们模块的属性,并进行了模块网络结构最小熵值的计算,获得较稳定的模块网络,利用Cytoscape软件进行了可视化。3.4模块生物功能注释运用DAVID软件对模块进行生物学功能富集分析,选用Functional Annotation Chart功能,设置人类全基因组数据(Human)作为参考背景,以P值<0.05筛选主要富集模块所对应的GO (Gene Ontology)生物功能和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路。3.5基因与中药的相关性分析根据重叠和各自独有的基因,在PubMed数据库中查找与基因相关的中药。检索词设定为“基因名”和“中药(herb)",检索范围限定为标题或摘要,通过对所检索到的文献全文阅读确定基因相关的所有中药,并对相关中药的检索结果计算相关系数,确定与疾病最相关的中药。3.6文献验证在PubMed数据库,检索范围限定为标题或摘要,对本研究重叠的基因和重叠的信号通路进行检索并全文阅读,找到与本研究内容相关的研究报道进行文献整理。4.研究结果4.1气虚血瘀证相关疾病根据纳入与排除标准对10796篇文献进行全文阅读,筛选出频次最高且属于“心、脑、肾”的气虚血瘀证相关疾病有脑梗死261篇、心绞痛255篇、糖尿病肾病9篇。4.2气虚血瘀证证候代表性症状经过全文阅读对气虚血瘀证三个疾病代表性症状进行规范化整理后得到(频次≥2)共有18个症状,其中,排在前5位的症状为：舌暗淡、气短乏力、脉沉细、胸痛、面色晦暗。4.3基因相互作用网络4.3.1气虚血瘀证证候和三个疾病的相关基因气虚血瘀证的18个症状中,仅有13个症状在OMIM数据库中查找到了相关基因1867个,脑梗死相关基因194个、心绞痛相关基因113个和糖尿病肾病相关基因129个。4.3.2重叠基因和独有基因网络的构建分析结果气虚血瘀证证候与疾病的重叠基因网络中,涉及脑梗死的有314个节点和738条边,心绞痛140个节点和259条边,糖尿病肾病189个节点和401条边；独有基因网络可视化结果显示,涉及脑梗死的有269个节点和505条边,心绞痛271个节点和1015条边,糖尿病肾病381个节点和3253条边,证候1104个节点和13472条边。4.4功能模块的识别结果重叠基因的功能模块中涉及脑梗死的有34个、心绞痛17个、糖尿病肾病23个；独有基因的功能模块涉及脑梗死的有39个、心绞痛25个、糖尿病肾病41个、证候270个。同时对模块的数量、尺寸大小、模块性和模块网络的最小结构熵值进行分析。4.5模块生物学功能的富集分析结果重叠基因的模块中,脑梗死相关模块富集出617个GO功能和65条KEGG信号通路,心绞痛相关模块富集出404个GO功能和32条KEGG信号通路,糖尿病肾病相关模块富集出281个GO功能和26条KEGG信号通路；独有的基因模块中,脑梗死相关模块富集出48个GO功能和12条KEGG信号通路,心绞痛相关模块富集出174个GO功能和38条KEGG信号通路,糖尿病肾病相关模块富集出372个GO功能和26条KEGG信号通路,证候相关模块富集出1165个GO功能和58条KEGG信号通路。4.6基因相对应的中药出现频次大于2且与重叠基因相关系数最大的中药包括黄芪、人参、牛膝；出现频次大于2且与独有基因相关系数最大的中药包括黄芪、当归、红花、穿心莲、淫羊藿、三七、肉桂、人参、马齿苋、雷公藤、青蒿,其中马齿苋、雷公藤、青蒿在中医传统组方中很少用于临床气虚血瘀证相关疾病的治疗。4.7文献验证结果气虚血瘀证证候分别与三个疾病的重叠基因中有10个(F2、F5、VEGF、 LMNA、GAA、FMD、ACE、CCR5、PKD1、ACE1)可能与血管紧张素转换酶存在相关性。共享的7条KEGG信号通路中发现三条KEGG通路至今未报道与三个疾病有关,而Allograft rejection与气虚血瘀证相关疾病的关系最紧密。5.结论1、通过基因网络和模块生物学功能分析,发现它们共有的病理机制与血管紧张转换酶相关,提示了气虚血瘀证与脑梗死、心绞痛和糖尿病肾病之间存在相类似的生物学机制,侧面论证了中医“同证异病”理论。2、基于中医“同证异病”理论,比较气虚血瘀证的代表性症状组与脑梗死、心绞痛、糖尿病肾病的基因网络,分析其模块的异同,为中医证候研究提供了新方法。3、通过文献分析与气虚血瘀证基因网络关联最高的中药,发现了3味中药不常用于气虚血瘀(马齿苋、雷公藤、青蒿),可能为气虚血瘀证临床新药的研发提供新的思路。