研究目的:在脊椎动物中,多巴胺是中枢神经系统中主要的神经递质,其通过与多巴胺受体的结合来调节多种功能。研究发现,多巴胺及其受体在帕金森病、精神分裂症等疾病中起到关键作用。但是研发这些疾病的药物的问题是有五种多巴胺受体亚型,但只有其中一种受到某种疾病的影响。因为他们的结合位点十分相似,所以很难设计治疗所需的具有最小副作用的亚型特异性激动剂和拮抗剂。因此对多巴胺受体的功能歧化的研究尤为重要,并为多种疾病的研究和治疗提供了重要的理论指导,但目前尚未有与受体功能歧化相关的研究。本研究收集了五种多巴胺受体基因的cDNA序列和氨基酸序列,旨在通过系统发育分析,研究脊椎动物中多巴胺受体家族的分子进化特征,并分析了多巴胺受体的功能歧化以及与功能歧化相关的特异性位点。研究方法:1.本研究选取了十种脊椎动物,即人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、猕猴(Macaca mulatta)、狗(Canis lupus familiaris)、牛(Bos taurus)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、原鸡(Gallus gallus)、非洲爪蛙(Xenopus tropicalis)、斑马鱼(Danio rerio),收集了五种多巴胺受体基因的同源氨基酸序列和cDNA序列。2.对所有受体的cDNA序列进行选择压力分析,计算dN/dS,分析它们承受的选择压力。3.整理五种受体基因的氨基酸序列。去掉序列的信号肽,然后进行多序列比对以及系统发育分析。4.在多序列比对以及系统发育分析的基础上进行功能歧化分析。5.推断与功能歧化相关的特异性位点。获得多巴胺受体间具有功能歧化相关的位点,并与蛋白质结构相结合,分析结构与功能之间的关系。研究结果:1.通过同源比对共收集到十种脊椎动物的5种多巴胺受体家族,即D1-D5,筛选后共得到47条氨基酸序列和47条cDNA序列。2.free-ratio模型中,多巴胺受体家族进化树中有些分枝的dN/dS值大于1,表明在这些分枝中存在正选择,发生了适应性进化,而大多数分枝上的dN/dS值均小于1,说明多巴胺受体在进化过程中负选择起主导作用。从数据来看,五种多巴胺受体亚基中D1和D2承受的选择约束更强,进化比较慢。3.多巴胺受体亚基家族的ML发育树展示了不同亚基的进化关系:在获得的系统树中,D1-like受体(D1和D5)形成一个簇,而D2-like受体(D2,D2和D5)形成另一个簇。由于相同类型的受体在功能上更相似,系统发育树的拓扑和功能分类是一致的。4.五种受体之间的两两比较得出受体之间存在I型功能歧化,即导致了不同的进化速度。在多巴胺受体之间发生了两次分歧事件,分歧一发生在D1-like和D2-like受体之间,分歧二事件分别发生在D1-like和D2-like受体中。5.D1-like与D2-like受体之间进行比较,在Qk>cut-off value的条件下,共得到84个不同的位点。这些位点在序列上不均匀分布,大多数位点位于比对序列的384?578区域,主要是与D1-like和D2-like受体之间的功能歧化相关。当这些位点映射到多巴胺受体的3D结构上时,35个包括在ICL3中,12个和14个分别包括在M6和M7中。这些位点可以作为相关研究的分子基础。研究结论:1.脊椎动物中的五种多巴胺受体的功能歧化分析中存在两个分歧事件。第一次发生在D1-like和D2-like受体分歧后。第二次分歧事件分别发生在D1-like和D2-like受体之间。因此,在基因复制后,在D1-like和D2-like受体之间形成稳定的差异。2.在D1-like与D2-like多巴胺受体之间的I型功能歧化相关的特异性位点分析中,总共识别了84个位点。其中,有16个位点可能是D1-like和D2-like受体中主要的功能歧化位点,16个位点中有6个是配体结合位点,它们可能与配体结合特性变化相关。3.另外,还发现一些位点与D1-like和D2-like受体之间和内部歧化都相关的位点,例如D177、P178、T179、N303、G304和Y365。这些结果表明,在基因复制后的进化过程中,特异性氨基酸位点的选择约束作用于多巴胺受体,这意味着两类受体分化后发生了进一步的分歧。这些位点为以后相关的研究提供了分子依据。