LncRNA CRNDE通过调节HMGB1胞浆移位影响心肌细胞凋亡在心衰进展中的机制研究

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yydx_2009
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心力衰竭是由于心脏结构或功能性疾病导致心室充盈或射血能力受损的一种复杂的临床综合征,发病率高,预后差,是各种心血管病发生发展的共同结局。心衰的发病机理是心肌细胞数目减少,而细胞凋亡在心功能障碍和结构改变中起着重要的作用。有研究表明,上调心肌锚定重复序列蛋白(Cardiac ankyrin repeat protein,CARP)会导致心肌细胞过度凋亡进而引发心衰,而通过调控血管紧张素Ⅱ-1型受体(angiotensin type 1receptor,AT1)-CARP信号通路可以抑制心肌细胞过度凋亡进而改善心衰。因此,研究心衰中心肌细胞凋亡的机制对缓解心衰的发展具有十分重要的意义。高迁移率族蛋白B1(High mobility group box-1,HMGB1)广泛存在于心脏等组织细胞中,与心脏、血管炎症反应密切相关。而当HMGB1过度乙酰化时则会发生胞浆移位,研究表明胞浆中高水平的HMGB1会影响心衰的进展。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)结直肠肿瘤差异表达基因(Colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE)是一种保守的心脏特异性lncRNA,参与调节缺氧时心脏祖细胞的增殖和迁移,lncRNA CRNDE过表达时可减轻小鼠的心肌纤维化,增强心功能。但lncRNA CRNDE在心衰中的作用和机制尚不清楚。本实验主要是探讨lncRNA CRNDE在心肌细胞凋亡及心衰进展中的作用及lncRNA CRNDE调控心肌细胞凋亡,进而影响心衰进展的机制。第一部分LncRNA CRNDE、PARP-1、HMGB1在心衰小鼠中的表达目的:检测lncRNA CRNDE、聚ADP核糖聚合酶1(poly-ADP-ribose polymerase 1,PARP-1)和HMGB1在心衰小鼠心脏组织和正常心脏组织中的表达。方法:雄性C57/BL6小鼠经阿霉素(Doxorubicin,Dox,20 mg/kg)诱导建立心衰模型,对照组小鼠注射等量生理盐水。注射Dox一周后取小鼠心脏组织。1.苏木素伊红(Hematoxylin–eosin,HE)染色观察模型组和对照组心脏病理情况。2.原位末端转移酶标记(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL)染色检测模型组和对照组细胞凋亡情况。3.免疫组化分析模型组和对照组中HMGB1的移位情况。4.实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测模型组和对照组心脏组织中lncRNA CRNDE的表达水平。5.Western blot检测模型组和对照组心脏组织中PARP-1蛋白和HMGB1蛋白的表达水平。6.免疫沉淀法检测HMGB1的乙酰化水平。结果:1.HE染色结果表明,对照组小鼠心肌纤维排列平行,胞核清晰,组织间隙正常,无炎性渗出;心衰模型小鼠心肌组织受损,纤维中断破坏且排列交叉无规律,部分心肌细胞质液泡化,且出现明显的炎性反应。2.TUNEL染色结果表明,与对照组相比,心衰小鼠模型组心肌细胞凋亡增加。3.免疫组化结果表明,与对照组相比,心衰小鼠模型组HMGB1从细胞核向细胞质转移。4.qRT-PCR结果显示,与对照组相比,心衰小鼠模型组心脏组织中lncRNA CRNDE表达明显减少(P<0.05)。5.Western blot结果表明,与对照组相比,心衰小鼠模型组心脏组织中PARP-1和HMGB1蛋白水平均有所升高。6.免疫沉淀结果表明,与对照组相比,心衰小鼠模型组心脏组织中HMGB1乙酰化水平升高。小结:在心衰小鼠模型中,lncRNA CRNDE表达减少、PARP-1和HMGB1的表达增加,提示lncRNA CRNDE、PARP-1、HMGB1可能与心衰的发生发展有关。第二部分LncRNA CRNDE对Dox诱导的小鼠心肌细胞凋亡的影响目的:在第一部分中,我们已经发现lncRNA CRNDE、PARP-1、HMGB1可能与心衰的发生发展有关,接下来我们研究过表达lncRNA CRNDE对小鼠心肌细胞凋亡的影响。方法:小鼠心肌细胞HL-1常规培养,用Dox(0.1μM)诱导HL-1心肌细胞损伤模型。将细胞分为4组:对照组、Dox处理组、Dox+pc DNA和Dox+pc DNA-CRNDE。用pc DNA-CRNDE质粒转染HL-1细胞48小时后,再经Dox处理24小时。1.qRT-PCR检测HL-1细胞中lncRNA CRNDE的表达水平。2.流式细胞术检测HL-1细胞凋亡情况。3.3,3’-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide Salt,XTT)法检测HL-1细胞活性。4.Western blot检测HL-1细胞中PARP-1蛋白和HMGB1蛋白的表达水平。结果:1.qRT-PCR结果表明,lncRNA CRNDE过表达后,lncRNA CRNDE的表达量升高,提示lncRNA CRNDE在HL-1细胞中成功过表达(P<0.05)。2.流式结果表明,与对照组相比,Dox组HL-1细胞中细胞凋亡明显增加,过表达lncRNA CRNDE时细胞凋亡减少(P<0.05),说明lncRNA CRNDE过表达抑制了Dox诱导的细胞凋亡增加。3.XTT结果表明,与对照组相比,Dox组HL-1细胞中细胞活力显著下降(P<0.05),而当lncRNA CRNDE过表达时,细胞活力明显提升(P<0.05),表明lncRNA CRNDE过表达可以显著提高HL-1细胞活力。4.Western blot结果表明,与对照组比较,Dox组HL-1细胞中PARP-1和HMGB1蛋白表达增加,过表达lncRNA CRNDE降低了PARP-1和HMGB1蛋白表达水平。小结:过表达lncRNA CRNDE可以抑制Dox诱导的小鼠心肌细胞凋亡。第三部分LncRNA CRNDE对PARP-1蛋白的稳定性的影响目的:在第二部分中,我们发现过表达lncRNA CRNDE降低了PARP-1和HMGB1蛋白表达水平,从而抑制Dox诱导的小鼠心肌细胞凋亡,在接下来的研究中,我们拟探究小鼠心肌细胞中CRNDE是否与PARP-1蛋白存在相互作用。方法:1.RNA免疫沉淀与RNA pull-down实验检测HL-1细胞中lncRNA CRNDE与PARP-1蛋白的结合与相互作用。2.HL-1细胞转染pc DNA或pc DNA-CRNDE 48小时后,qRT-PCR检测HL-1细胞中lncRNA CRNDE、PARP-1 m RNA的表达水平。3.HL-1细胞转染pc DNA或pc DNA-CRNDE 48小时后,采用Western blot检测HL-1中PARP-1蛋白水平。4.HL-1细胞转染pc DNA或pc DNA-CRNDE 48小时后,用蛋白合成抑制剂环己酰亚胺(Cycloheximide,CHX,50μg/m L)处理细胞0,2,4,8小时,检测不同时间点PARP-1蛋白的降解情况。结果:1.RNA免疫沉淀与RNA pull-down结果表明,HL-1细胞中lncRNA CRNDE与PARP-1蛋白确实存在结合与相互作用(P<0.05)。2.qRT-PCR与Western blot结果表明,HL-1细胞中过表达lncRNA CRNDE对PARP-1 m RNA水平没有显著影响,但是却降低了PARP-1的蛋白水平。3.CHX结果表明,lncRNA CRNDE过表达后,PARP-1蛋白稳定性随着CHX处理时间的延长而逐渐减弱(P<0.05)。小结:在HL-1细胞中,lncRNA CRNDE与PARP-1蛋白存在结合与相互作用,而过表达lncRNA CRNDE降低了PARP-1蛋白的稳定性。第四部分HL-1细胞中PARP-1对HMGB1胞浆移位的调控作用目的:我们已经发现lncRNA CRNDE可以影响PARP-1蛋白的稳定性,下面我们将探讨PARP-1是否对HL-1细胞中HMGB1乙酰化及HMGB1胞浆移位和释放具有调控作用。方法:HL-1细胞分组:对照组、Dox处理组、Dox+DMSO、和Dox+ 3-AB组(3-氨基苯甲酰胺,3-aminobenzamide,3-AB,为PARP-1的抑制剂)HL-1细胞用3-AB(10 m M)预处理2小时后,再用Dox处理24小时。1.PARP活性检测试剂盒检测HL-1细胞中PARP-1的活性。2.HL-1细胞裂解液用anti-HMGB1抗体进行免疫沉淀,并以抗乙酰化-赖氨酸抗体进行Western blot以检测HMGB1的乙酰化水平。3.提取HL-1细胞质和细胞核蛋白,Western blot检测细胞质和细胞核中HMGB1蛋白的水平。4.酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HL-1细胞上清中HMGB1的蛋白水平。结果:1.PARP活性检测试剂盒检测结果表明,在HL-1细胞中,Dox诱导后PARP-1活性提高,而3-AB处理后PARP-1活性降低(P<0.05)。2.Dox处理后HMGB1乙酰化水平升高,3-AB处理后HMGB1乙酰化水平降低。3.Western blot分析表明,Dox处理后,HL-1细胞质和细胞上清液中HMGB1表达升高,细胞核中HMGB1表达降低,而在3-AB处理后,这些效应被逆转,即HL-1细胞质和细胞上清液中HMGB1表达减少,细胞核中HMGB1表达增加(P<0.05)。4.ELISA结果表明,Dox处理后HL-1细胞上清中HMGB1浓度升高,3-AB处理后HL-1细胞上清中HMGB1浓度降低。小结:PARP-1在小鼠心肌细胞HL-1中调控HMGB1胞浆移位。第五部分LncRNA CRNDE通过PARP-1/HMGB1通路抑制Dox诱导的HL-1细胞凋亡目的:探究lncRNA CRNDE在Dox诱导的HL-1细胞凋亡中如何发挥作用。方法:将HL-1细胞分为四组:Dox、Dox+pc DNA、Dox+pc DNACRNDE、Dox+pc DNA-CRNDE+pc DNA-PARP-1。将pc DNA-CRNDE和pc DNA-CRNDE+pc DNA-PARP-1分别转染到HL-1细胞,48小时后,再用0.1μM的Dox处理细胞24小时。1.流式细胞术检测HL-1细胞凋亡。2.XTT法检测HL-1细胞活性。3.qRT-PCR检测HL-1细胞中lncRNA CRNDE的表达水平。4.Western blot检测HL-1细胞中PARP-1蛋白水平和细胞质与细胞核中HMGB1蛋白的表达水平。结果:1.流式细胞术结果表明,过表达lncRNA CRNDE可抑制HL-1细胞凋亡,同时过表达PARP-1可促进HL-1细胞凋亡(P<0.05)。2.XTT结果表明,过表达lncRNA CRNDE可促进HL-1细胞活性,同时过表达PARP-1可抑制HL-1细胞活性(P<0.05)。3.qRT-PCR结果表明,过表达lncRNA CRNDE后,HL-1细胞中lncRNA CRNDE表达增加(P<0.05),同时过表达PARP-1则对lncRNA CRNDE的表达无明显影响。4.Western blot结果表明,过表达lncRNA CRNDE后,HL-1细胞中PARP-1和细胞质HMGB1蛋白水平降低,细胞核HMGB1蛋白水平升高,而这些趋势在同时过表达PARP-1后被逆转,即PARP-1和细胞质HMGB1蛋白水平升高,细胞核HMGB1蛋白水平降低。小结:LncRNA CRNDE通过PARP-1/HMGB1轴抑制Dox诱导的HL-1细胞凋亡。结论:1.LncRNA CRNDE在心衰小鼠模型及Dox诱导的小鼠心肌细胞HL-1中表达下调。2.LncRNA CRNDE通过结合PARP-1下调PARP-1蛋白水平,阻止HMGB1乙酰化、胞浆移位及释放,从而抑制心肌细胞凋亡,对心脏起到保护作用。
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