昆虫病原真菌是唯一通过直接穿透体壁侵染宿主的病原微生物,其侵染过程涉及孢子附着寄主体壁、萌发、分化形成侵染结构-附着胞,附着胞分化形成侵染菌丝,在机械压力和水解酶的协同作用下穿透昆虫体壁。侵染菌丝一旦进入昆虫血腔,分化形成芽生孢子,称之为虫菌体,以逃避宿主免疫反应。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一种国内外广泛用于农林以及卫生害虫生物防治的昆虫病原真菌,也是研究病原真菌与宿主及环境互作的模式真菌之一。研究发现,球孢白僵菌虫菌体表面特化为一层规则的“刷状”凸起,并且与体外培养的细胞有不同的表面特征和理化性状,推测该结构与病原真菌逃避昆虫血腔免疫识别相关。课题组前期研究发现,该“凸起”结构主要由蛋白质组成,通过比较蛋白组学鉴定了分生孢子、体外芽生孢子和虫菌体表面/分泌蛋白谱,发现6个虫菌体特异表达蛋白。解析这些特异表达蛋白,将有助于揭示昆虫病原真菌逃避宿主免疫反应的新策略,同时为提升生防真菌应用效果提供理论支撑。漆酶广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物（包括昆虫）,参与多种不同的生理学及生物学过程。球孢白僵菌分泌性Laccase 2（Op S5,BBA＿08183）属于次级代谢产物卵孢菌素合成基因簇,参与卵孢菌素合成。前期研究发现,Laccase 2存在于虫菌体特异表达的表面/分泌蛋白库,推测其与虫菌体表面结构形成有关,在病原真菌与宿主昆虫互作中扮演了不同的角色。本文通过表达特性分析、细胞分布及分泌特性分析,结合基因敲除及过表达、异源表达及酶学功能研究等策略,探究了Laccase 2（命名为BbLac2）与球孢白僵菌逃避昆虫免疫反应的关系及作用机制。BbLac2蛋白主要研究结果如下:1.BbLac2表达受昆虫营养、氧化胁迫及昆虫酚类物质的诱导采用RT-qPCR及启动子控制GFP荧光标签探究了BbLac2的表达特性,结果表明,BbLac2在虫菌体中高表达,受昆虫营养（血淋巴或体壁）、氧化剂（menadione、tert-Butyl hydroperoxide和H2O2）及昆虫内源性酚类物质（L-thyrosine、3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine（L-DOPA）或5,6-dihydroxyindole）的诱导。进一步利用启动子与GFP融合的标签菌株,结合RT-qPCR,比较分析了Op S1（oosporein polyketide synthase）和BbLac2在球孢白僵菌侵染致病过程中的表达特性。研究发现,Op S1在侵染宿主死亡12 h后开始表达（72 hpi）,24 h后（84 hpi）转录水平逐步下降。而BbLac2在真菌进入昆虫体内（36 hpi）开始表达,接种48-72 h后转录水平呈上升趋势,84 h后下降。由此表明,BbLac2除参与卵孢菌素合成,在病原菌与宿主免疫互作过程中扮演了其它的角色,可能参与菌株对昆虫营养利用、响应氧化胁迫及解毒酚类物质等过程。2.BbLac2既分布于虫菌体表面,也可分泌至胞外通过构建表达BbLac2::GFP融合基因菌株,检测了BbLac2在真菌细胞（GFP信号）的分布。结果显示,BbLac2仅特异性分布于虫菌体细胞壁或细胞表面。为探究BbLac2的分泌特性,分别将BbLac2编码区和去除信号序列（sp BbLac2）与GFP融合,置于组成型启动子之下,构建PB3::BbLac2::GFP和PB3::BbLac2-sp::GFP菌株。结果显示,PB3::BbLac2::GFP的荧光信号均分布在真菌各种形态细胞的细胞壁或细胞表面,而PB3::BbLac2-sp::GFP的GFP荧光则均匀分布于真菌细胞内。Western blot检测发现,PB3::BbLac2::GFP细胞培养液中检测到融合蛋白,表明BbLac2可以分泌至胞外基质。3.BbLac2独立于卵孢菌素合成参与氧化胁迫反应为进一步探究BbLac2的生物学功能,分别构建了BbLac2基因破坏（ΔBbLac2）、回复互补（Comp）和超量表达(BbLac2OE)菌株。研究发现,破坏BbLac2显著增强了菌株对氧化胁迫的敏感性,而BbLac2OE菌株对氧化胁迫的耐受性略有增强。然而,不产生卵孢菌素的ΔOp S3菌株对氧化胁迫的敏感性与野生菌株无明显差异。由此表明,BbLac2独立于卵孢菌素合成参与菌株氧化胁迫反应。4.BbLac2参与虫菌体表面特性形成鉴于BbLac2是一个细胞壁蛋白或表面蛋白,进而分析基因破坏和过表达对细胞表面特性的影响,分别用三种荧光标记的凝集素concanavalin A（Con A）（识别α-glucose、mannose和α-Ν-acetylglucosamine（Glc NAc））、wheatgerm agglutinin（WGA）（识别β-Glc NAc和sialic acid residues）和Galanthus nivalis（GNL）（识别mannose residues）以及荧光标记的β-1,3 glucan抗体（特异性识别病原相关分子模式β-1,3glucan）检测碳源表位。结果表明,ΔBbLac2虫菌体对3种凝集素的结合活性与野生菌株无明显差异,但对β-1,3 glucan抗体的结合活性显著增强。相反,超量表达菌株BbLac2OE虫菌体对3种凝集素的结合活性显著增强,该结果与BbLac2蛋白存在多个推测的N-糖基化位点一致。而且,过表达菌株对β-1,3 glucan抗体的结合活性显著降低。由此表明,BbLac2为虫菌体表面蛋白,同时扮演了表面蛋白的角色,“隐蔽”包括β-1,3 glucan在内的病原相关分子识别模式。5.BbLac2是一个菌株的毒力因子,参与免疫逃避反应采用“经典”体壁接种和体腔注射接种大蜡螟三龄幼虫两种方式进行生物测定。结果表明,两种接种方法的结果一致,破坏BbLac2菌株导致菌株毒力降低,感染昆虫的死亡率均显著降低,致死中时(LT50)明显延长,而过表达菌株BbLac2OE的毒力显著高于野生亲本菌株（WT）,LT50缩短。真菌致死昆虫后,BbLac2OE、Comp、WT和ΔOp S3菌丝穿出僵虫体壁生长和产孢,而很少有菌丝从ΔBbLac2侵染的昆虫体壁穿出生长,表明破坏BbLac2削弱了白僵菌穿透僵虫体壁的能力。由此表明,BbLac2是一个维持球孢白僵菌毒力的因子。免疫反应检测发现,微量注射接种ΔBbLac2菌株48 h后的昆虫体表发生严重的黑化现象,而BbLac2OE处理的昆虫则没有观察到明显的黑化现象,推测ΔBbLac2易激活昆虫免疫反应。显微观察显示,接种36-48 h,BbLac2OE孢子在虫体内萌发并快速逃避血细胞的“包裹”,而ΔBbLac2孢子或芽管则易被血细胞“包裹”并发生典型的黑化。qPCR检测菌体在虫体内的增殖量,BbLac2OE的增殖显著快于WT,而ΔBbLac2增殖量则低于WT。与之相反,接种BbLac2OE孢子的昆虫血细胞数量低于野生菌株的处理,而ΔBbLac2感染的血细胞数量则显著高于WT处理的昆虫。由此表明,BbLac2参与病原菌逃避昆虫免疫反应。6.BbLac2解毒昆虫免疫反应产生的活性氧和干扰酚氧化酶级联反应为探究BbLac2参与真菌逃避昆虫免疫反应的机制,分别检测了菌株侵染大蜡螟幼虫后与昆虫免疫反应相关的活性氧（ROS）水平及酚氧化酶（PO）活性。以活性氧敏感的荧光探针CM-H2DCFDA检测“包裹”免疫反应中血细胞内的ROS水平,发现BbLac2OE侵染昆虫的荧光强度明显低于WT处理,而ΔBbLac2接种的荧光强度与WT处理无明显差异。以H2O2作为ROS分子代表,定量检测真菌侵染的昆虫血淋巴中ROS水平,也显示相似的变化趋势。由此表明,BbLac2具有清除免疫反应产生ROS的功能。为进一步探究BbLac2清除ROS的潜在机制,利用甲醇诱导的毕赤酵母表达BbLac2。表达的BbLac2蛋白具有典型的漆酶活性,在p H 7.0-13范围及20oC-50oC条件下,BbLac2均具有较高的ROS清除活性。在p H=8.0和40oC条件下,BbLac2清除H2O2活性随蛋白浓度的增加而增强。酚氧化酶（PO）活性检测结果表明,接种真菌孢子0-10 h,昆虫PO活性显著上升,然后呈下降趋势。然而,ΔBbLac2侵染昆虫PO活性显著高于WT处理,而接种BbLac2OE 6 h后的PO活性显著低于WT侵染的昆虫,表明其更容易逃避昆虫免疫识别。为揭示BbLac2影响PO活性的可能机制,采用典型的PO酚类底物L-DOPA测定BbLac2活性。结果表明,在p H 6.0-9.0之间,BbLac2对L-DOPA具有相对高的活性。在含有L-DOPA的Czapek平板上添加BbLac2后,形成明显的黑色素物质。由此表明,BbLac2具有氧化PO底物酚类物质的活性,干扰PO合成及介导的免疫反应。为探究破坏和超量表达BbLac2对宿主昆虫免疫途径的影响,分析了真菌侵染昆虫12 h后3个Toll途径基因Sp（?）tzle、Dorsal和BGBP1（β-1,3 glucan binding protein基因）和14个抗菌肽基因基因表达水平。结果表明,与WT侵染的昆虫相比,ΔBbLac2侵染的昆虫中3个Toll途径基因和11个抗菌肽基因显著上调,而3个Toll途径基因和13个抗菌肽基因在BbLac2OE侵染昆虫中却显著低于WT侵染的昆虫。研究结果进一步证实了BbLac2具有参与病原菌逃避昆虫免疫反应的角色。综上研究结果表明,BbLac2在病原菌逃避昆虫免疫反应中扮演了多功能角色。病原菌在侵入昆虫血腔时特异表达BbLac2,分泌到昆虫血淋巴,不仅参与卵孢菌素合成抑制昆虫免疫反应,而且参与清除免疫反应产生活性氧和氧化PO底物干扰其介导的免疫级联反应,同时BbLac2作为一种表面蛋白,“隐蔽”β-1,3 glucan等病原相关分子模式,有助于真菌逃避昆虫免疫识别。