论文部分内容阅读
目的:观察在水杨酸钠(sodium salicylate,SS)作用下,大鼠螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons,SGN)上 GABAA受体(γ-aminobutyric acid a receptor,GABAAR)活动对 NMDA 受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)mRNA和蛋白的影响,进一步完善水杨酸钠耳毒性的受体机制。方法:体外培养新生SD大鼠SGN,采用免疫荧光检测NMDA受体的NR2B亚单位表达,荧光定量PCR和Western blot观察不同浓度水杨酸钠(0.5或5 mM)作用下,分别激动或抑制GABAA受体对NMDA受体的NR2B亚单位mRNA、蛋白和磷酸化水平的影响。结果:(1)免疫荧光显示,SGNs的胞体和突起均有NR2B的表达;(2)0.5/5 mM水杨酸钠、10 μM蝇蕈醇(GABAA受体激动剂)和20 μM荷包牡丹碱(GABAA受体抑制剂)加入培养液处理30分钟后,荧光定量PCR结果显示,蝇蕈醇使NR2B mRNA的表达下调10.96%(F=43.084,P=0.003<0.05),而水杨酸钠可逆转蝇蕈醇的下调作用;荷包牡丹碱使NR2B mRNA的表达上调21.40%(P=0.003<0.05),其与水杨酸钠联合作用使上调程度更明显(P=0.000<0.05);上述所有改变在酪氨酸激酶Fyn的抑制剂PP2作用下均消失(F=0.921,P=0.552>0.05);(3)与上述(2)相同方法处理后,Western blot结果显示,蝇蕈醇使NR2B膜蛋白的表达下调7.39%(F=14.501,P=0.005<0.05),水杨酸钠与蝇蕈醇共同作用可使下调程度更明显(P=0.000<0.05),其中0.5/5 mM水杨酸钠和蝇蕈醇联合作用与单纯蝇蕈醇比较,分别减少30.82%、55.33%;荷包牡丹碱使NR2B膜蛋白的表达上调15.73%(P=0.005<0.05),水杨酸钠与荷包牡丹碱共同作用可逆转这一过程(P=0.012<0.05),其中0.5/5 mM水杨酸钠和荷包牡丹碱联合作用与单纯荷包牡丹碱比较,分别减少14.23%、29.72%。上述各处理组的总蛋白与对照组比较无明显改变(F=1.111,P=0.401>0.05);与mRNA改变相同,上述改变在PP2作用下均消失(F=0.436,P=0.884>0.05);(4)与上述(2)相同方法处理后,Western blot观察激酶和NMDA受体磷酸化水平。结果显示,蝇蕈醇可下调Fyn、p-Y1472蛋白的表达,荷包牡丹碱可上调Fyn、p-Y1472蛋白的表达(P<0.05)。其中,0.5mM、5mM水杨酸钠和蝇蕈醇共同作用与单独蝇蕈醇作用比较下调程度更明显(P<0.05),Fyn 蛋白分别减少 17.48%、48.65%,p-Y1472 蛋白分别减少 25.82%、29.95%;0.5 mM、5 mM水杨酸钠与荷包牡丹碱共同作用可逆转单独使用荷包牡丹碱的作用(P<0.05),Fyn蛋白分别减少20.91%、33.06%,p-Y1472蛋白分别减少25.43%、54.60%。然而,水杨酸钠和GABAA受体活动时,各处理组的CK2蛋白与对照组比较无明显改变(F=0.742,P=0.655>0.05),同时 p-S1480 蛋白亦无改变(F=1.230,P=0.337>0.05)。结论:(1)GABAA受体激活可使NMDA受体NR2B mRNA的表达下调,水杨酸钠可减弱该下调作用;(2)GABAA受体激活可促进NMDA受体内化,且水杨酸钠可易化该内化作用;(3)Fyn依赖的Y1472位点磷酸化介导水杨酸钠和GABAA受体调节NMDA受体的内化。