花生根腐病菌(Fusarium spp.)的种类鉴定及细胞壁降解酶的酶学性质研究

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花生是重要的油料作物,根腐病是花生生产中最严重的病害之一,在花生的整个生育期均可以侵染。引起花生根腐病的病原菌主要为镰刀菌(Fusarium spp.),目前对花生根腐病菌的种类及其致病机制,尤其是病菌细胞壁降解酶的酶学性质尚缺乏系统的研究。本研究对山东主要花生产区的根腐病菌的种类进行鉴定,并对病菌产生的纤维素酶和木聚糖酶的酶学性质进行检测和分析,主要研究结果如下:1、花生根腐病菌的种类鉴定及生物学特性从山东省不同地区采集花生根腐样本,共分离出60株分离物,致病力测定发现,不同菌株对花生幼苗都有致病性,但致病力存在显著差异。形态观察、结合EF-1α序列分析,60株分离物有51株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、3株为层出镰刀菌(F.proliferatum)、4株为茄病镰刀菌(F.solani)、1株为锐顶镰刀菌(F.acuminatum)、1株为串珠镰刀菌(F.moniliforme)。选取8株代表菌株,测定了pH、温度对病原菌菌丝生长速率的影响。结果表明,多数菌株在15~33℃条件下均能生长,适宜温度是25~28℃;不同菌株最适pH不同,多数菌株的最适生长pH为5-7。2、花生根腐病菌细胞壁降解酶的酶活性质测定选取强致病力的两株尖孢镰刀菌(F.oxysporum)菌株Foxy4、Foxyh和致病力较弱的茄病镰刀菌(F.solani)菌株Foxy2,比较了各菌株产生的细胞壁降解酶的酶的活性,结果表明,Foxy4产生的纤维素酶和木聚糖酶活性最高,而茄病镰刀菌(F.solani)Foxy2的纤维素酶和木聚糖酶活性最低。酶学测定发现,菌株Foxy4和Foxyh的纤维素酶的最适反应温度和最适反应pH基本一致,分别为60℃和pH 4;两菌株产生的木聚糖酶的最适反应温度和最适反应pH分别为50℃和pH 4。分别以微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、木聚糖和大豆粉为诱导培养基诱导并测定三株菌株产纤维素酶和木聚糖酶的活性。结果表明,不同诱导培养基诱导纤维素酶和木聚糖酶的效果不同。其中,羧甲基纤维素钠培养基诱导纤维素酶的效果最好,木聚糖培养基诱导木聚糖酶的效果最好。3、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)Foxy4木聚糖酶Focel10的酶学性质测定通过异源表达结合蛋白纯化系统,获得纯化的重组木聚糖酶Focel10,并分析重组木聚糖酶Focel10的酶学性质。以木聚糖为底物,测定木聚糖酶Focel10的最适反应温度和最适反应pH,发现其最适反应温度为50℃,最适反应pH为4;热稳定性测定发现,木聚糖酶Focel10经50℃处理1h,仍有较高的活性;底物特异性检测结果表明,木聚糖酶Focel10对羧甲基纤维素钠、支链淀粉、阿拉伯半乳聚糖、甘露聚糖、葡聚糖、磷酸膨胀纤维素没有明显的水解作用;金属离子Co2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Ca2+都能降低木聚糖酶Focel10的水解活性;Tween-20、Triton X-100、Methanol、Ethanol、Isopropand、EDTA、SDS降低木聚糖酶Focel10的水解活性。通过薄层层析法分析木聚糖酶Focel10降解木聚糖的水解产物,发现其水解产物大多为聚合度较低的寡糖,且随着时间的增加寡糖的含量也越多。
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